CCF20121201011

1

Ćwiczenia AĄ

Oznaczanie aktywności fosfatazy

zasadoweiilurowicy krwi zwierząt gospodarskich

Fosfatazy stanowią w organizmie ssaków grupę szeroko rozpowszechnionych enzymów które katalizują reakcje hydrolizy estrów fosforanowych. Różnią się one właściwościami fizykochemicznymi , a przede wszystkim optimum pH, dlatego wyróżnia się fosfatazy kwaśne (pH 4-6) i zasadowe (pH 8-9). Fosfatazy kwaśne występują w większych ilościach w kościach, jelicie oraz w wątrobie. Fosfataza zasadowa występuje w wątrobie, nerkach a także w śledzionie , łożysku i erytrocytach. W obrębie komórek fosfatazy znajdują się przede wszystkim w lizosomach, siateczce śródplazmatycznej, aparacie Gol^iego oraz w cytoplaźmie.

Aktywność fosfataz oznacza się za pomocą syntetycznych substratów jak (3-glicerofosforan, fenylofosforan. W zależności od stosowanego substratu oznaczenie aktywności enzymu opiera się na określeniu ilości uwolnionego po hydrolizie fosforu (metoda Bodeńskiego) lub ilości odszczepionego fenolu (metoda Folina Ciocaltou).

W metodzie Bodańskiego fosfatazy surowicy krwi rozkładają p-glicerfosforan na glicerol i nieorganiczny fosforan. Przebieg reakcji jest następujący:

CHoOH    CH₂0H

I    *    I

H-C-O-PCUHo    ^fosfata-.^ CHOH    + H,PO.

I ^    + H₂°    |    ■

ch₂oh    ch₂oh

Zasada: po inkubacji w temp. 37°C w środowisku zasadowym oznacza się ilość odszczepionego fosforu nieorganicznego. Po dodaniu molibdenianu amonu w środowisku kwaśnym powstaje kwas fosfomolibdenianowy , który redukuje się . Po dodaniu kwasu 1,2,4 -aminonaftosulfonowego powstaje związek o niebieskim zabarwieniu.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: surowica

KH₂P0₄ (zawiera 8ug fosforu w 1 ml)

0,5% p- glicerofosforan sodu 60% CCL₃ COOH 2,5% molibdenian amonu

0,25% eikonogen (kwas 1,2,4-aminonaftosulfonowy)

Sporządzenie krzywy standardowej;

	kh2po4 (ml)	h2o (ml)	Stężenie P w probówkach
Probówka 1	0,5	2,5	—> 4 pg P /3 ml
Probówka 2	1,0	2,0	—> 8 pg P /3ml
Probówka 3	2,0	1,0	—»16 pg P/3 ml
Probówka 4	3,0	-	—> 24 pg P/ 3ml