CCF20100311002

Wykonanie

Przygotować i wykonać oznaczenie aktywności enzymu w pH 4.0, pH 7.0 oraz oznaczenie aktywności enzymu traktowanego wysoką temperaturą (bezpośrednio przed oznaczeniem wstawić enzym na 5min do łaźni o temp. 90stC, następnie przenieść do lodu) w pH 7.0

1.    Do probówek Eppendorfa pipetujemy 63 pl 2% RNA i 0.125 ml odpowiedniego buforu. Tak przygotowane próby umieszczamy w łaźni i po 5 min dodajemy 63 pl zawiesiny enzymu. (Przygotować i wykonać próby z wszystkimi przygotowanymi buforami). Do próby kontrolnej nie dodajemy enzymu.

2.    Próby inkubuj emy 3 0 min w 3 7stC.

3.    Po inkubacji dodać do każdej z nich po 90 pl silnie oziębionego 2M HC1 i umieścić w lodzie. Zamieszać i postawić na 30min w łaźni z lodem. Do prób kontrolnych dodajemy najpierw HC1, następnie enzym.

4.    Próby odwirować (5 min, 15tys obr/min).

5. Do suchych probówek przenieść 25 pl supematantu i dodać 975pl H2O - wymieszać.

6.    Pomiaru absorbancji uzyskanych prób wykonać przy 260nm.

Aktywność enzymu wyrażamy w jednostkach aktywności RNazy, jako zmianę absorbancji. Jednostką aktywności w tej analizie jest przyrost absorbancji równy 0,01. Zmiana absorbancji dotyczy produktu reakcji (polinukleotydów i nukleotydów), który rozpuszcza się w kwasach.

Uzyskane wyniki zebrać i przedstawić w tabeli oraz opatrzyć stosownym komentarzem.

3