CCF20100324004

Wykonanie oznaczenia:

Aktywność dehydrogenazy oznaczamy w: 1/ homogenacie (20xrozcienczyć), 2/ frakcji 10P (5xrozcienczyć), 3/ oczyszczonych mitochondrach (10xrozcienczyć). Dla każdej z tych frakcji przygotowujemy 3 probówki.

Do 2 probówek pipetujemy po 0,6ml substratu (25 mM bursztynian w buforze fosforanowym) - próby badane. Do 1 probówki dodajemy 0,6 ml lOOm M buforu fosforanowego pH 7,4 -próba zerowa. Do każdej z probówek dodajemy 0,2ml roztworu INT.

Tak przygotowane mieszaniny inkubacyjne umieszczamy w łaźni wodnej o temp. 37°C. Po 5min. preinkubacji do każdej z nich dodajemy w równych odstępach czasu (3Osek) 0,2 ml odpowiedniej frakcji. Po kolejnych 15 minutach inkubacji reakcję hamujemy dodając 1.5 ml mieszaniny octan etylu/etanol/TCA. Próby natychmiast mieszam do momentu, w którym zniknie w nich zmętnienie. Następnie mierzymy ich absorbancję przy X = 470 nm w szklanych kuwetach.

D. Oznaczanie białka:

Białko oznaczany w: 1/ homogenacie (50xrozcienczyć), 2/ frakcji 10P (5xrozcienczyć), 3/ oczyszczonych mitochondriach (10xrozcienczyć).

W odpowiednio rozcieńczonych frakcjach oznaczamy stężenie białka metodą Bradford. W tym celu dla każdego rozcieńczenia przygotowujemy 4 probówki (3 próby badane i 1 próba zerowa). Do prób badanych pipetujemy po 1 OOjllI odpowiednio rozcieńczonych frakcji, a do próby zerowej lOOpł 50mM Tris-HCl pH 7,6. Do wszystkich frakcji dodajemy 2ml odczynnika Bradford. Po wymieszaniu mierzymy absorbancję prób przyX = 595 nm.

Opracowanie wyników:

Uśrednij uzyskane dla każdej frakcji wyniki absorbancji. następnie używając współczynnika kalibracji dla formazanu (k = 1,95 nmole INT-formazan/próbę) oblicz aktywność dehydrogenazy.

Podobne obliczenia wykonaj dla ilości białka w każdej z frakcji (k = 45,0 iig/lOOul). Jeśli próby zostały rozcieńczone, pamiętaj o uwzględnieniu tej operacji przy obliczaniu aktywności enzymu i stężeniu białka w próbach!!

Zadania

Wykorzystaj uzyskane wyniki do obliczenia aktywności właściwej dehydrogenazy bursztyniamrwej w homogenacie i każdej z uzyskanych frakcji mitochondriów. Oceń jak zmienia się aktywność właściwa na kolejnych etapach izolacji mitochondriów.

Czy na podstawie aktywności właściwej dehydrogenazy można ocenić czystość uzyskanych mitochondriów ?

Czy dehydrogenazę bursztynianową można uznać za enzym znacznikowy ( markerowy) mitochondriów ? Jeśli tak to dlaczego?

Literatura

Biochemia. Berg J.M„ Tymoczko J.L, Stryjer L, (2005) PWN Warszawa

Cytobiochemia. Kłyszejko-Stefanowicz L, (2002) PWN Warszawa

Ćwiczenia z biochemii, Kłyszejko-Stefanowicz L - Redaktor (199) PWN Warszawa