DSCN7134

Oznaczanie aktywności dehydrogenazy izocytrynianowej

Dehydrogenaza izocytrynianowa (BHGI) drożdży jest enzymem allosterycznym. Katalizuje oksydatywną dekarboksylację L-izocytrynianu do a-ketoghitaranu. Koenzymem dehydrogenazy w tej reakcji jest NAD⁺. Aktywność tego enzymu jest regulowana z udziałem kilku efektorów takich jak NAD⁺, ABP i Mg^z+ oraz NADH. Reakcja ta jest głównym punktem regulacji szybkości przemian w cyklu kwasu cytrynowego.

L-izocytrynian + NAD⁺-► a-ketoglutaran + NADH + H* + CO2

Miarą aktywności enzymu jest przyrost zredukowanego NAD⁺ (NADH) z maksimum absorpcji X = 340nm.

Materiały:

1. Świeże drożdże piekarnicze	150g
2. Celit	-
3. 30mM bufor Tris-HCl pH7,4	500mł
4. 100 mM dwuwęglan sodu w H2O	2Q0mł
5. 3,0 mM D,L izocytrynian sodu w buforze (3)	200ml
6. 2 mM NAD^+ w buforze (3)	250ml
7. 6 mM AMP w buforze (3)	15ml
8. 100mMMgCl2 WH2Ó	50ml
9. Moździerz
10. Łaźnia wodna 30°C
11. Spektrofotometr
12. Wirówka

Metody:

1. Preparatyka enzymu dehydrogenazy izocvtrvnianowei:

Drożdże piekarnicze (10g) rozcieramy z celitem a następnie dodajemy porcjami 20ml lOOmM dwuwęglanu sodowego (w stosunku lg : 2ml) i ponownie ucieramy na jednolitą masę (ściana komórkowa drożdży jest bardzo wytrzymała na mechaniczne urazy!). Homogenat przenosimy do zlewki na 100 ml i sonifikujemy 6 i 10”z przerwami 20” (Uwaga! zlewka z preparatem powinna być podczas sonifikacji umieszczona w lodzie). Przenosimy homogenat do probówki wirówkowej. Probówki równoważymy bardzo starannie używając wagi a następnie wirujemy w wirówce Beckman przy 25 000 obrotów/min przez 35min. Delikatnie zbieramy pipetą supematant do zlewki i pozostawiamy w temperaturze pokojowej. Osad odrzucamy. W uzyskanym preparacie oznaczamy aktywność dehydrogenazy izocytrynianowej i stężenie białka (met. Bradford).

2. Przygotowanie substratu:

Do doświadczeń przygotuj L-izocytrynian o następujących stężeniach: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4, 0,5; 0,6 mM. W tym celu pobierz od 0,1 do 1,2 ml roztworu DL-izocytrynianu (5) i I uzupełnij.buforem do objętości.3. .tal.