DSCN7135

3* Oznaczanie aktywności enzymu;

Przed oznaczeniem zmieszaj w kolbie stożkowej:

lml MgCl₂ z 2,5 ml 30 mM buforu Tris-HCl pH 7,4 i 15 ml NAD⁺ (mieszanina M) Przyholowania próby „ 0 ”

W kuwecie spektrofotometru zmieszaj:

1,85 ml przygotowanej mieszaniny (M)

1,2 ml substratu o dowolnym stężeniu 0,2 ml HaO

Wstaw do spektrofotometru. Ustaw długość fali s| — 340nm. Wyzeruj przyrząd.

Pomiar aktywności próby 'Właściwej

W kuwecie spektrofotometru zmieszaj :

1,85 ml p przygotowanej mieszaniny (M)

1,2 ml substratu o najwyższym stężeniu Wstaw do spektrofotometru

Reakcję rozpocznij dodając 0,2 ml enzymu, włącz stoper i w ciągu kolejnych 4 min. co 1 min notuj zmiany absorbancji przy 1 = 340nm. Jeżeli absorbancja przekroczy wartość 0,9 enzym fóżćieńcz 2-krotnie.

Wykonaj analogiczne oznaczenia dla pozostałych stężeń substratu.

4. Oznaczanie białka metoda Bradfbrd

Uzyskany preparat enzymatyczny rozcieńcz 0,9% NaCl 50 razy (0,lml preparatu i 4,9ml 0,9% NaCl). Pobierz 3 próby po 100pl (próby badane) i łOOfil 0.9%NaCl (próba zerowa). Następnie do wszystkich prób dodaj 2ml odczynnika Bradford. Zmierz absorbancję przy długości fali | = 595nm względem próby zerowej.

Opracowanie wyników:

1.    Używając molowego współczynnika absorbcji dla NADH oblicz aktywność enzymu ‘wyrażoną ilością zredukowanego HAT) na minutę na ml (dmołe/rriin/ml).

2.    Oblicz aktywność właściwą preparatu.

3.    Sporządź wykresy:

a.    zależności szybkości reakcji v od stężenia substratu [Śj

b.    zależności l/v od 1/[S]

c.    zależności log v/(V- v) od log [A]

4.    Na podstawie wykresu (c) wyznacz współczynnik Hilla i [S]so oraz oblicz wartość stałej kompleksowej K.

Obliczenia:

Aktywność właściwą enzymu wyrażamy w pmolach na minutę na mg białka czyli w U na mg białka:

(pmol x min"¹ x mg białka ^_1)

( U x mg białka ^_1)

<    3    3    1

Współczynnik absorbcji molowej dla NADH w 340 nm wynosi 6,22 x 10 I x M^-' x cm' więc 1 (imol/ml NADH ma absorbancję 6,22.