99

Szkło i inne pomoce

I. Do oznaczania stałej Michaelisa-Menten i aktywności enzymu — na dwóch studentów przypada: 18 probówek Hagedoma ze statywem i garnkiem, po 1 kolbie miarowej na 25 i 50 ml, po 1 pipecie chemicznej na 1 i 2 ml, koszyczek druciany oraz na grupę przy stole po 2 pipety chemiczne na 2 i 5 ml.

13. Do oznaczania aktywności enzymu i poziomu białka — na jednego studenta przypada: -

4    probówki Hagedoma, 3 probówki chemiczne, 1 kolba miarowa na 25 ml, po 1 pipecie chemicznej na 1 i 2 ml oraz na grupę przy stole: po 2 pipety chemiczne na 2 i 5 ml, 1 pipeta serologiczna na 1 ml, 1 statyw' z garnkiem, 2 koszyczki druciane.

Wykonanie

Otrzymany w kolbie miarowej wyciąg enzymowy należ)’ uzupełnić woda do kreski i dokładnie wymieszać.

1.    Oznaczanie aktywności Do 4 probówek Hagedoma odmierzyć po 5 ml mleczanu (2) oraz po 2 ml zbuforow’anego żelazicyjanku (4 ), w-stawić na 5 min do łaźni w'odnej o temp. 37°C. Po 5 min do dwóch probówek (próby pełne) dodać po 2 ml wyciągu enzymowego i inkubować w temp. 37°C przez 30 min.

Następnie przerwać reakcję, dodając w takiej samej kolejności jak dodawano enzym po

5    ml mieszaniny (5 ), wymieszać i wstawić do zimnej wody. Do prób kontrolnych dodać również po 5 ml mieszaniny (5 ). po czym po 2 ml wyciągu enzymów-ego.

Wydzielony jod możliwie szybko odmiareczkować 0,002-molowym tiosiarczanem sodowym (6 ), kończąc miareczkow-anie wobec skrobi (7).

2.    'Wyznaczanie stałej Michaeiisa-Memen — K_m. Do ośmiu enzymatycznie czystych probówek Hagedoma ponumerow-anych parami odmierzyć kolejno po 5 ml mieczami o różnych stężeniach (3 ), tj. do pierwszych dwóch roztwór zawierający 1 umoi. do następnych dwóch — 2 umole w- 1' ml itd. Do wszystkich probówek dodać po 2 mi zbuforowanego roztworu żelazicyjanku (4 ), po 1 ml wody destylow-anej i wstawić na 5 min do łaźni wodnej o temp. 37°C. Jednocześnie przygotować dwie próby kontrolne, odmierzając 5 ml mleczanu (3 ) zawierającego 6 tymoli w 1 mi (stężenie mleczanu nie wypływa na w-artość próby kontrolnej), 2 ml żelazicyjanku (4 ), 1 ml wody destylowanej i wstawić również do łaźni wodnej.

Po 5 min z kolby na 50 ml dodać kolejno do wszystkich prób pełnych po 2 ml wyciągu enzymowego, wymieszać i natychmiast wstaw-ić do łaźni wodnej; zanotować czas dla poszczególnych prób i inkubować w^r temp. 37°C przez 30 min.

Następnie przerwać reakcję, dodając w takiej samej kolejności jak dodawano enzym po 5 ml mieszaniny (5 ), wymieszać i wstawić do zimnej wody. Do prób kontrolnych dodać również po 5 ml mieszaniny (5 ), po czym po 2 ml wyciągu enzymowego.

Wydzielony jod możliwie szybko odmiareczkow-ać 0,002-molowym tiosiarczanem sodowym (6 ), kończąc miareczkowanie wobec skrobi (7 ).

3.    Oznaczanie białka. Do jednej probówki odmierzyć 1 ml wody (próba kontrolna), a do dwóch po 1 mi wyciągu enzymowego. Do wszystkich probówek dodać po 5 ml odczynnika miedziowego (8 ), wymieszać i pozostawić na 10 min. Następnie dodać po 0,5 ml odczynnika Folina (9), wymieszać i po 30 min odczytać przepuszczalność w fotometrze przy 670 nm.

88