72724 skanuj0014

fosfataza

R-O-PO3H +h₂o

» R-OH + H₂P0₄

Do oznaczeń aktywności fosfataz stosujemy nie fizjologiczny substrat: fosforan p-nitrofenolu (pNPP). Fosfatazy hydrolizują wiązanie estrowe pNPP zgodnie z reakcją:

O

fosfatazo

.p-nitrofenol (pNP)

j?-nitrofenylofosforan (pNPP)

Produktem tej reakcji jest p-nitrofenol, który w silnie alkalicznym pH ma barwę żółtą. Natężenie tej barwy jest wprost proporcjonalne do ilości zhydrolizowanych wiązań estrowych i ilości uwolnionego fosforanu.

Jednostką aktywności enzymatycznej (U) jest taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 jimola substratu w ciągu 1 min w temp. 30°C w optymalnym dla enzymu stężeniu substratu oraz związków lub jonów niezbędnych dla jego sprawności katalitycznej, inaczej mówiąc w warunkach optymalnych dla badanego enzymu.

W preparatach uzyskanych z tkanek roślin i zwierząt wyznaczamy również aktywność właściwą enzymów.

Aktywność właściwa to liczba jednostek aktywności (U) przypadająca na 1 mg białka (U/mg białka).

Odczynniki:

1. 8mM fosforan p-nitrofenolu w H₂0

2.0. 2 M bufory octanowe pH 4,0 - 6,5 3. 0,1 MNaOH

4.0. 9% NaCl

Przygotowanie enzymu:

Schłodzony w lodówce ziemniak obierz i zetrzyj na tarce. Uzyskaną masę wyciśnij starannie przez nylon do niewielkiej zlewki. Otrzymany przesącz wiruj przez 10 min przy 3000 obrotów/min. Supematant przenieś do probówki, oznacz stężenie białka metodą Bradford i używaj do dalszych analiz. Pamiętaj, aby uzyskany ekstrakt przechowywać w lodówce, bowiem większość białek jest stabilna w niskich temperaturach (0 do 4°C)!

Ekstrakt z ziemniaka rozcieńcz 250-krotnie 0,9% NaCl (w kolbie miarowej).

Analiza wpływu pH na aktywność fosfatazy kwaśnej:

Do 18 probówek napipetuj po 0,25 ml 8mM roztworu fosforanu p-nitrofenolu i 0,25 ml buforu o pH od 4,0 do 6,5. Zestaw obejmuje 12 probówek, w których oznaczamy aktywność i 6 probówek stanowiących próby „0”. Próbówki ogrzej przez 5 min w łaźni wodnej o temp. 37°C. Następnie posługując się stoperem w odstępach 30 sekundowych dodaj do każdej z