96

Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśne). Do dwóch probówek odmierzyć po 1 mi 4-nitrofenylofosforanu (2), 1,5 ml buforu octanowego (3) i 1,5 ml wody, a do próby kontrolnej 1,5 ml buforu (3) i 2^5 ml wody.

Probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 38°C i po ok. 5 min dodać do wszystkich probówek po 1 ml wyciągu enzymu, wymieszać, zanotować czas, wstawić do łaźni wodnej na 10 min.

Po 10 min przerwać działanie enzymu, dodając kolejno do probówek po 5 ml węglanu sodowego (4 ), wymieszać i oznaczyć absorbancję w fotometrze przy 420 nm, ustawionym na zero wobec próby kontrolnej.

Opracowanie wyników

1.    Obliczyć ilość pg uwolnionego w reakq'i 4-nitrofenolu, dzieląc absorbanq'ę przez współczynnikjabsorbancjijdla 1 pg 4-nitrofenolu równy 0,002. Sporządzić wykres zależnos'ci szybkości reakcji od stężenia enzymu, odkładając na osi rzędnych pmole 4-nitrofenolu, a na osi odciętych ml enzymu.

2.    Dość utworzonego 4-nitrofenolu obliczyć w pg, jakpodano w punkcie 1. Dla poszczególnych stężeń substratu obliczyć 1/[S ] w mol^-' • 1” , pamiętając, że substrat wyjściowy został rozcieńczony w mieszaninie inkubacyjnej do 5 ml, oraz odwrotność szybkości l/v (w pmolach produktu). Sporządzić wykres zależności szybkości reakcji od stężenia substratu, odkładając na osi rzędnych l/v (pmole 4-nitrofenolu), a na osi odciętych 1/[S ]) mole 4-nitrofenylofosfo-ranu). Przedłużyć linię do przecięcia się z ujemną częścią osi x, z otrzymanej wartości -1 IK_m obliczyć stałą K_m i podać jej wartość prowadzącemu ćwiczenia.

3.    Dla średniej wartościjabsorbancjijz prób równoległych obliczyć ilość 4-nitrofenolu w pg, jak podano w punkcie 1. Podać wynik prowadzącemu ćwiczenia i uwzględniając rozcieńczenie obliczyć aktywność fosfatazy kwaśnej w pmolach 4-nitrofenolu na 1 g siewek pszenicy na 1 minutę.

b. Wyznaczanie stałej K_m dehydrogenazy L(+) mieczanowej drożdżowej i oznaczenie aktywności właściwej tego enzymu

Dehydrogenazy mleczanowe. Enzymy te należą do klasy oksydoreduktaz i katalizują biologiczne procesy oksyćacyjno-redukcyjne. W komórkach zwierzęcych występuje dehydrogenaza mleczanowa mięśniowa współdziałająca z NAD⁺, która może zapoczątkować w warunkach tlenowych typowy łańcuch oddechowy następującą reakcją utleniania mleczanu do pirogronianu:

CH₃ • CHOH • COO" + NAD⁺—* CHy CO • COO" + NADH + K*

Natomiast dehydrogenazy mleczanowe występujące w komórkach drożdży różnią się zasadniczo od enzymu mięśniowego budową, mechanizmem działania i rolą. Dehydrogenazy mleczanowe drożdżowe są flawoproteinami, z których trzy są specyficzne w stosunku do D(-) mleczanu i jedna do izomeru L(+).

Dehydrogenaza zdolna do utleniania izomeru L(+) mleczanu, która jest przedmiotem ćwiczenia, zawiera ok. 6% DNA silnie związanego z białkiem oraz równe liczby moli FMN i protohemu. W czasie reakcji utleniania pierwszym akceptorem elektronów i protonów jest

85