20101020039

Laboratorium 3 BIAŁKA SUROWICY KRWI

Ćwiczenie 1: Rozdział elektroforetyczny białek surowicy Krwi na aoarozie Istotę elektroforezy stanowi wędrówka w polu elektrycznym cząsteczek mających dodatni i ujemny ładunek elektryczny Proces rozdzielania tych cząsteczek polega na różnicy szybkości ich wędrowania w roztworze lub w nośnikach (bibuła Żele) Elektroforeza Zelowa wykorzystuje porowate substancje żelowe (jak agaroza Zel poliakrylamidowy). co pozwala na uzyskany lepszego rozdziału mieszaniny związków, gdyż oka sieci żelu stanowią sito oieKuiarr ?• dodatkowo rozdzielające cząsteczki

Cząsteczki białka mają właściwości amfoteryczne - w zależności od pH występna u postaci anionowej lub kationowej Podczes elektroforezy białek surowicy krwi na agarozc wzywany jest bufor o pH 8.6 W takim pH bulka surowicy krwi mają charakter elek'"; •/ w polu elektrycznym przemieszczają się w kierunku anody (♦) Rozdziel eie«troforetyczny --- " surowicy na żelu agarozowym pozwala na uzyskanie 6 frakcji tneiek surowicy c , r. j a2-globuIiny. (31-globuliny. |32-globuliny oraz y-gtobukny

W celu przeprowadzenia rozdziału ałektroforetycznego tanek surowicy kraś należy ^akszyc ; odpowiednio rozcieńczonej surowicy (po 5 pL) na pły*>ę zełu agarorowego Naslęprae oauBZOną płytkę umieszcza się w komorze elektrofor etycznej tak. by mwjsca oarezer.a ^ -ow c z-ą-c: ..s-. się od strony katody (-) Elektroforezę przeprowadza ttą * zarr«komorze przez 2C mev przy napięciu 100 V Po rozdziale białka są utrwalane na zeki za pomocą roztworu-mieszarvry kwas/aikohol, a następnie barwione przy użyciu roztworu czarni amidowej Nadn*ar barwo - s usuwany jest za pomocą kwaśnego roztworu Po odbarwianiu oraz wysuszeniu zet jest gosc»\ do odczytu deneytometrycznego

Po otrzymaniu odczytu z densytometru oceń uzyskana frakcje białek surowicy krwi u badanego pacjenta i sformułuj wnioski dotyczące etanu zdrowia pacjenta.

Ćwiczenie 2: Oznaczanie stężenia białka w surowicy Krwi metodą bturetawa a) Przygotowanie krzywej wzorcował

Z roztworu standardowego albuminy (10mg/mL w 0.9% roztworze NaGI) przygotuj (używając 0.9% NaCI jako rozpuszczalnika) roztwory o objętości końcowej v * 0.5 mL zawierające białko o stężeniach: 2, 4, 6, 8,10 rng/mL Do każdej probówki zawierającej białko o odpowiednim stężaniu dodaj po 2 mL 0,9% roztworu NaCI, a po wymieszaniu po 2.5 mL odczynnika biuretowsgo Zawartość probówek dokładnie wymieszaj Przygotuj próbę żarową (ślepą) zawierającą 2.5 mL 0.9% NaCI i 2,5 mL odczynnika biuretowego.

Po 20 minutach zmierz absorbancję prób badanych wobec próby ślepej na spektrofotometrze przy długości fali A = 525 nm.

Korzystając z uzyskanych wyników przygotuj na papierze milimetrowym wykres zełeznoeoi abaorbancji (oś Y) od stężenia białka (oś X) oraz oblicz współczynnik kalibracji K (C'A)