(1)

Rozdział elektroforetyczny białek. Izoenzymy.

Wstęp.

Ełektfofefcza.

Jedną z nąj wszechstronniejszych i najpowszechniej stosowanych w biochemii i dziedzinach pokrewnych metod rozdziału związków jest elektroforeza, znana w licznych odmianach i modyfikacjach. Podstawowym zjawiskiem wykorzystywanym w tej metodzie jest zróżnicowana ruchliwość jonów w polu elektrycznym. W zależności od posiadanego ładunku wypadkowego ruch odbywa się w kierunku do katody lub do anody. Szybkość i kierunek poruszania się cząsteczek w polu elektrycznym są uzależnione od wypadkowego ładunku elektrycznego cząsteczki (zależnego z kolei od jonizacji własnych grup funkcyjnych lub grup funkcyjnych jonów zaadsorbowanych ze środowiska, a co za tym idzie od pH środowiska), wielkości i kształtu cząsteczek (im większy stosunek ładunku do wielkości, tym szybciej się przemieszczają), siły' jonowej elektrolitu (im większa tym wędrówka jonów wolniejsza), temperatur)', sił tarcia w środowisku, gradientu potencjału, natężenia prądu i innych czynników Zależnie od sposobu przeprowadzania rozdziału wyróżnia się dwa podstawowe rodzaje elektroforezy: elektroforezę swobodną (prowadzoną w roztworach, np. stabilizowanych gradientem gęstości) oraz prowadzoną na nośnikach, którymi są materiały o strukturze porowatej lub żelowej - np. bibuła filtracyjna, żele poliakrylamidowe, agarowe, krzemionkowe i inne.

(tXikladaicjszc omówienie fi7*k.ocbcui»c/XK cłcknofcuczy patrz np.: Analiza instrumentalna w biodrami. Skrypt dla studentów biologii (specjalność: biologia molekularna) Praca zbiorowa jxxl red A Kleina i A.Kozika; Wyd UJ. Kraków 19S9; do wypożyczenia up w bibliotece IBM. Informacje o literaturze doi. 23gadnicń łcduicZDych, analitycznych itp. można uzyskać u prowadzącego ćwiczenia )

Obecnie najbardziej rozpowszechnione są trzy metody elektroforctyczne.

- eiekuoforćza żelowa; w żelu poliakrylamidowym, agarczcwym lub skrobiowym żel służy do stabilizowania środowiska rozdziału, ponadto można uzyskiwać żele o różnych średnicach porów dla polepszenia rozdziału, wykorzystując zasadę sito molekularnego. Metoda elektroforezy w żelu połiakryłamidowyrn (PAGE) jest chyba najpowszechniej używaną metodą elektroforetyczną - ćwiczenie opisane poniżej będzie wykonywane właśnie tą metodą. Odmiana PACIE w obecności detergentu (najczęściej dodecylosiarczanu sodu - SDS) może służyć w odpowiednich warunkach do oznaczania masy cząsteczkowej nieznanych białek przez porównanie z białkami o znanej masie cząsteczkowej. SDS powoduje denaturację białek i tworzy z nimi kompleksy o stałym Stosunku SDS-białko. Kompleksy takie posiadają bardzo duży i prawie jednakowy ujemny ładunek pochodzący z dysocjacji reszt siarczanowych, w związku z czym ruchliwość elektroforetyczną jest uzależniona tylko od wielkości cząsteczki kompleksu.

• ogniskowanie izoclektryczne (izoelektroogniskowanie) polega na prowadzeniu elektroforez)' w- stałym gradiencie pH otworzonym między anodą i katodą. Wykorzystano tu zjawisko mcoddziaływania pola elektrycznego na cząsteczki o zerowym ładunku wypadkowym. Substancje rozdzielane elcklroforetycznie mają zazwyczaj własności amfoteryczne. Cząsteczki obdarzone ładunkiem wędrują w trakcie elektroforezy w kierunku elektrody o przeciwnym znaku. Podczas wędrówki przez gradient pil ładunek