13796

Do rozdziału mieszaniny białek stosuje się zazwyczaj elektroforezę na żelu poliakrylamidowym, natomiast rozdział kwasów nukleinowych prowadzi się na żelu skrobiowym.

Do zilustrowania procesu elektroforezy niech posłuży następujący przykład. Mieszaninę białek nakłada się na szczyt krótkiej płytki żelowej, zamkniętej pomiędzy dwoma płytkami szklanymi. Żel rozdzielający jest spolimeryzowana mieszaniną dwóch monomerów akrylowych : akrylamidu i bis-akrylamidu o odpowiednio dobranym stosunku wagowym. Układ rozdzielający jest zawieszony w specjalnym aparacie w taki sposób, że płytka Zelowa tworzy mostek pomiędzy dwoma zbiornikami wypełnionymi odpowiednimi buforami. Bufory jako elektrolity przewodzą prąd. Do jednego zbiornika przyłączona jest elektroda ze znakiem ujemnym , natomiast do drugiego ze znakiem ujemnym, natomiast do drugiego ze znakiem dodatnim. Po włączeniu prądu stałego cząsteczki białek umieszczone na szczycie kolumny lub płytki żelowej migrują w polu elektiycznym z prędkością zależną od ich masy cząsteczkowej i wypadkowego ładunku.

Żelowe układy rozdzielające są czymś w rodzaju sita cząsteczkowego z przestworami o wielkościach przez które mogą migrować cząsteczki białka wraz z przepływającym buforem, w którym są rozpuszczone. Migracja białek w żelowych układach rozdzielających zależy od 3 czynników: 1) wielkości cząsteczek białka, 2) kształtu cząsteczek, 3) ich ładunku elektrycznego. Cząsteczki duże przemieszczają się wolniej przez żel rozdzielający niż cząsteczki małe, ponieważ napotykają na duży opór sita poliakrylamidowego. Podobny efekt wywołują cząsteczki o kształcie włókienkowatym lub elipsoidalnym.

Czynnikiem, który wpływa znacząco na szybkość i kierunek wędrówki cząsteczek białka w żelach rozdzielających, jest ich ładunek elektryczny, a ściślej mówiąc stosunek liczby ładunków dodatnich lub ujemnych do powierzchni cząsteczek . stosunek ten można określić jako gęstość ładunku elektrycznego . im większa jest gęstość ładunku cząsteczek, tym szybciej migrują one w kierunku elektrody o przeciwnym znaku.

Odpowiednio dobrane pH ma istotny wpływ na szybkość kierunek wędrówki cząsteczek. Jeśli rozpuści się białko w buforze , którego pH jest bardziej kwaśne niż w punkcie izoelektrycznym tego białka (wartość pH, w którym ładunek wypadkowy jest równy 0), to cząsteczki migrują w kierunku katody. W przypadku przeciwnym, to znaczy, jeżeli bufor jest bardziej zasadowy od wartości w punkcie izoelektrycznym, cząsteczki białka wędrują w kierunku anody. Jeżeli natomiast pH buforu ma dokładną wartość punktu izoelektrycznego danego białka , to jego cząsteczki nie wędrują, zostają w żelu nieruchome.

W celu rozdzielenia mieszaniny białek według ich masy cząsteczkowej, elektroforezę przeprowadza się w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS). Poszczególne łańcuchy białek tworzą kompleksy z cząsteczkami SDS posiadającymi ładunki ujemne elektryczne i migrują w kierunku anody zgodnie z masą cząsteczkową. Duże kompleksy składające się z podjednostek białkowych, których łańcuchy są połączone mostkami dwusiarczkowymi (-S-S-), należy przed rozdziałem zredukować za pomocą merkaptoetanolu rozbijającego wiązania dwusiarczkowe. Dopiero po takim zabiegu rozpuszcza się białka w buforze SDS i przeprowadza rozdział na żelu poliakrylamidowym.