20101020038

Laboratorium 3 BIAŁKA SUROWICY KRWI

Ćwiczenie 1. Rozdział alektroforetyczny białek surowicy (rry/i p« atiarpz.e Istotę elektroforezy stanowi wędrówka w polu elektrycznym cząstaczek mających dodatni lub ujemny ładunek elektryczny Proces rozdzielania łych cząsteczek polega na różnicy szybkość ich wędrowania w roztworze lub w nośnikach (bibuła, Żela) Elektroforeza żelowa wykorzystuje porowate substancje żelowe (jnk agaroza żal połiakrylamldowy). '.o pozwala na jzysfcur. lepszego rozdziału mieszaniny związków, gdyż oka sieci talu stanowią sito molekularne dodatkowo rozdzielające cząsteczki

Cząsteczki białka mają właściwości amfołeryczne - w zależności od pH występu,» postaci amonowej lub kationowe! Podczas elektroforezy białek surowicy krwi na agarore 'zrywany jest bufor o pH 8.8 W takim pH białka surowicy krwi mają charakter elektroujemny ■ w polu elektrycznym przemieszczają arę w kierunku anody (♦) Rozdział elektroforetyczny (We^* eurosrcy na żelu agarozowym pozwala na uzyskanie 0 trakcji b:;i'ek surowicy krwi s1tx.rr.r7 ol-gioc -d2-globuliny, (31-globulmy. 02-globulmy oraz y-globuliny

W celu przeprowadzana rozdziału eiektroforetycznego bWe* s. • jv. .7 krwi    -y.•

odpowiednio rozcieńczonej surowicy (po 5 uU ne płytkę żelu <. ■    . Nastw-e oauszoną

płytkę umieszcza się w komorze ełetoeśorerycznei tak. by mnjeca meozeme :.-:vrc oiajdcwar. się od strony katody (-). Elektroforezę przeprowadza sę w zj.- ■ komorze przez 20 mai przy napięciu 100 V Po rozdziała białka są utrwalane na MU za pomocą raehsonHmeezamny kwaefMnhnł a następnie barwiono przy uzyou roowuw czarni a- : -.s| Nadm 3- barwnaca usuwany jest za pomocą kwaśnego roztworu Po odbanwenu oraz wysuszemu ze jast golow. do odczytu deneytornetrycznago

Po otrzymaniu odczytu z densytometru oceń uzyskana kamąe fretek surow.cy krwi u badanego paqenta 1 sformułuj wnioski dotycząca stanu zdrowia pacjenta

Ćwiczenie 2r Oznaczanie łażenia błafca w naowtcy krwi metoda bsiretowa a) Przyootewame toZYwei wzomaat

Z roztworu standardowego albuminy (10mg/mL w 0,9% roztworze NaCI) przygotuj (używając 0 9% NaCI jako rozpuszczalnika) roztwory o objętości końcowej v ■ 0,5 mL. zawierające bi3«o o stężeniach 2. 4, 6. 0, 10 mg/mL Do każdej probówki zawierającej białko o odpowiednim stężemu dodaj po 2 mL 0.6% roztworu NaCI. a po wymieszaniu po 2.5 mL odczynnika biuretowego Zawartość probówek dokładnie wymieszaj Przygotuj próbę żarową (ślepą) uwierającą 2 5 mL 0.9% NaCI 12.5 mL odczynnika biuretowego

Po 20 minutach zmierz absorbancję prób badanych wobec próby ślepej na spektrofotometrze przy długości fali A = 525 nm

Korzystając z uzyskanych wyników przygotuj na papierze milimetrowym wykres zależności absorbancji (oś Y) od stężenia białka (oś X) oraz oblicz współczynnik kalibracji K (CfA)