CIMG4089

W podanym poniżej przykładzie śmiertelność zakażonych zwierząt, lub wystąpienie efektu cytopatycznego w zakażonych hodowlach, po wprowadzeniu wirusa była przy rozcieńczeniu 10^-3 większa niż 50%, natomiast przy rozcieńczeniu 10^-4 mniejsza niż 50%.

Uzyskany współczynnik dodaje się do wartości ujemnego logarytmu, przy którym uzyskano ponad 50% śmiertelności zwierząt lub zarodków kurzych, bądź wystąpienie efektu cytopatycznego. Miano wirusa wyrażamy jednak nie w ujemnym logarytmie dziesiętnym, lecz w dodatnim (tab. 5).

Tabela 5. Mianowanie wirusów*

Rozcień czenie wirusa	Odczyt efektu cytopa tycznego lub śmiertel ność	Liczba zwierząt		Dane kumulatywne
		padlych lub hodowli z CPE	żywych lub hodowli bez CPE	liczba zwierząt		śmiertelność lub CPE
				pad łych lub hodowli z CPE	żywych lub hodowli bez CPE	pomiar	%
10"*	6/6	6	0	17	0	17/17	100
io-^ł	6/6	6	0	11	0	11/11	100
io-»	4/6	4	2	5	2	5/7	71
io-^4	1/6	1	5	1	7	1/8	13
io-»	0/6	0	6	0	13	0/13	0

• Wg: E.H. Leńnett i N.J. Schmidt

W tym przypadku 50% śmiertelności lub wystąpienie CPE uzyskano przy rozcieńczeniu 1000-krotnym. A zatem 50% dawka śmiertelna lub cytopatyczna będzie wynosić 10"^3,36 w odniesieniu do danego wirusa danych zwierząt lub hodowli komórkowej i w odniesieniu do jednostki objętości, dla której obliczano miano wirusa.

W przypadku wirusów, które choć namnażają się u zwierząt, w zarodku kurzym lub w hodowlach komórkowych in vitro, to jednak nie powodują zmian cytopatycznych lub nie zabijają zwierzęcia, można wykazać ich obecność za pomocą innych metod na podstawie określonych właściwości wirusów. Metody te wykorzystują zjawiska aglutynacji krwinek czerwonych, hemadsorpcję, interferencje lub oznaczenia immunofluorescencyjne.

Drugą wspomnianą wyżej, niezmiernie przydatną, metodą oznaczania miana zakaźnego jest metoda oparta na tworzeniu przez wirusy w określonych warunkach doświadczalnych w hodowli komórkowej in vitro łysinek. Miano wirusa określa się wówczas symbolem PFU (PFU = plaque forming units = jednostki powodujące powstanie łysinek) lub PFU_S0. Stosuje się takie same wzrastające rozcieńczenia mianowanego preparatu wirusowego, zakaża się nimi jednowarstwową (monolayer) hodowlę komórkową, pokrytą następnie warstwą żelu, umiejscawiającego wiriony aktywne. W takich hodowlach komórkowych, zakażonych górnymi rozcieńczeniami wirusa, uzyskuje się ogniskowe zmiany cytopatyczne - łysinki z koloniami wirusów potomnych.

Podstawowym założeniem jest, że łysinka powstaje z jednej aktywnej cząstki wirusowej. Jest to założenie w zasadzie słuszne, kiedy w warstwie zakażonych komórek uzyskuje się niewiele - od kilku do 20-30 odrębnych łysinek. Przy większym stężeniu wirusa (mniejsze rozcieńczenia mianowanego preparatu wirusowego) łysinki zlewają się, uniemożliwiając obliczenie miana. Należy jednak pamiętać, że jedna łysinka może powstać w następstwie działania więcej niż jednego wirusa, i że podczas replikacji może dojść do zmian w zakaźności i chorobotwórczości potomnych wirusów, od których zależy wytworzenie łysinek.

Obliczenie miana w wartościach PFU_S0 można przeprowadzić również metodą Reeda i Muencha. Natomiast wykazanie miana bezpośredniego w wartościach PFU nie wymaga obliczania danych kumulatywnych, lecz jest iloczynem rozcieńczenia i liczby łysinek w jednostce objętości mianowanej zawiesiny wirusowej.

Metoda oparta na PFU daje wartości miana takie same jak uzyskiwane metodą opartą na oznaczeniu TCID_S0. Sama zaś technika i zasada metody są przydatne w badaniach nad jednorodnością populacji wirusa (klonowanie) oraz w badaniach genetycznych.

Zarówno w przypadku oznaczania wartości miana w TCI!D_S0, jak i PFU, ID_S0 itp. należy pamiętać, że oznaczane jest miano zakaźne wirusa, a nie bezwzględna liczba zakaźnych cząstek wirusa, zawartych w badanym materiale. Liczba ta może być bowiem równa mianu lub od niego większa. Ogólnie uważa się, że wartość miana równa się lub jest do 10 razy mniejsza od rzeczywistej zawartości zakaźnych wirionów w mianowanym preparacie wirusowym.

Należy również pamiętać, że na wartość mianowania może rzutować wiele czynników związanych z komórkami organizmu zwierzęcego in vivo i z komórkami hodowli in vitro oraz czynników środowiska odżywczego zakażonej hodowli i czynników ustrojowych (inhibitory, temperatura itp.). Wynik mianowania powinien być powtarzalny. W szczególnych przypadkach (np. oznaczanie miana wirusa w szczepionkach), w których oznaczanie miana musi być szczególnie ścisłe, przeprowadza się oznaczenia wielokrotne (na ogół 3-6-krotne), pobierając zawiesinę wirusa z różnych pojemników (probówek, ampułek), w których jest przechowywana.

W optymalnych warunkach laboratoryjnych różnice pomiarów nie przekraczają ± 0,3 log, a w każdym razie nie powinny wynosić więcej niż ± 0,5 log. W takich przypadkach, gdy konieczne jest dokładne podanie wartości miana wirusa, podaje się wartość średnią z oznaczeń oraz wartości graniczne, np. miano TCID₅₀ ||M§