określenie dokładnej lokalizacji receptorów w błonie. Zarazem silne powinowactwo tych toksyn pozwala na oczyszczenie receptorów uwalnianych z błony.
Receptor ten można wyizolować z Won w formie rozpuszczalnej przy użyciu detergentów niejonowych, oczyścić stosując chromatografie powinowactwa na kolumnach zawierających unieruchomioną toksynę kobry i wypłukać.
Najlepiej poznano budowę receptora N-ACh z płytek elektrycznych płaszczki Torpedo, gdzie stanowi on 25% ogólnego białka Won. podczas gdy w sarkolemic kręgowców jego zawartość nie przekracza 1%. Kompleks (250-270 kD) zawiera 4 różne polipeptydy: wiążący ACh a-40 i strukturalne P-49. y-57 i 8-65 kD. ułożone w pentamer o składzie a;py6. Otwarcie kanału następuje po kooperatywnym związaniu dwóch cząsteczek acetylocholiny, po jednej przy każdej podjednostce a. Wymienione 4 typy polipeptydów są niezbędne, a zarazem wystarczające dla zapewnienia funkcji receptora z postsynaptycznej Wony mięśniowej. Metodą wprowadzania do oocytu żaby (nie mającego receptora ACh-N) klonowanych mRNA dla 4 typów pod jednostek Torpedo wykazano, że opuszczenie któregokolwiek typu powodowało całkowity lub znaczny brak czynności kanału (rys. 32.4).
Wszystkie te podjednostki wykazują znaczną homologię sekwencji przy końcu N (35-40%). Sugeruje się. że ich odrębne dziś geny powstały drogą amplifikacji wspólnego progenu. Każda z podjednostek zawiera prawdopodobnie 4-5 a-helis przechodzących w poprzek błony. Kanał kationowy wytworzony jest wspólnie przez helisy M2 należące do każdej z 5 jednostek. Otwór kanału ma prawdopodobnie 0.65-0.80 nm średnicy, co umożliwia przenikanie zarówno Na* jak i K* z ich otoczką hydratacyjną.
Szczególna rola w helisach M2 przypada prawdopodobnie resztom aminokwasowym o ładunku ujemnym (rys. 32.6.b). np. Glu w podjednostce 5 oraz Glu” i Asp w podjednostce p. Pewne cząsteczki organiczne o ładunku dodatnim, np. chlorpromazyna. mająca zdolność wytwarzania wiązań poprzecznych z resztami seryny (254P i 2625) występującymi w środku helis M2. blokują funkcję receptora przez ..zaczopowanic” kanału. Przez wprowadzenie do oocytu żaby mRNA zmutowanych podjednostek kanału udowodniono, że redukcja przewodnictwa jonowego w powstałym kanale jest proporcjonalna do ilości reszt glutaminianu lubasparaginianu w helisach M2 zastąpionych przez np. lizynę. Reszty te tworzą więc prawdopodobnie przy każdym z obu wyjść do kanału pierścień umożliwiający wiązanie jonów Na* i K*.
Model budowy receptora Torpedo jest w ogólnym zakresie słuszny także dla N-AChR z nerwowo-mięśniowych synaps ssaków, przynajmniej z aspekcie wymiarów, struktury antygenowej i zachowanej proporcji polipeptydów: cCjpyS. z tym że masy są nieco odmienne: np. a-41| kD. P-50 kD. y-53 kD. 8-56 kD. Poza tym podjednostka y występuje tylko w receptorach zarodkowych, a w receptorach organizmów dorosłych jest zastąpiona podjednostką e (ctipeS). Odmienny podtyp stanowi N-AChR występujący w postsynaptycznej błonie neuronowej mózgu kurczęcia złożony jako pentamer ohp3 tylko z 2 typów podjednostek: a (a2. a3 ...) i P (ft>. pj ,..). które po ekspresji mRNA. uzyskanego z cDNA. w oocytach tworzą w pełni funkcjonalny receptor jonotropowy. Nic jest on blokowany przez a-ncuroloksyny. natomiast blokują go pewne Ugandy, które z kolei aktywują receptor mięśniowy. Pomimo tych różnic, oba podtypy N-AChR mają zbliżone właściwości farmakologiczne i podobną charakterystykę kanałów jonowych.
Receptor N-ACh może swobodnie dryfować w błonie embrionalnej komórki mięśnia szkieletowego. Jednak w kilka godzin po wytworzeniu kontaktu włókna mięśniowego z rosnącym nerwem, receptory ulegają agregacji w ograniczonym postsynaptycznym obszarze błony, osiągając zagęszczenie I -5 x IO*/mm*. Zarazem zanik, we wczesnych etapach życia pozapłodowego. wielu zakończeń nerwowych — tworzących uprzednio presynapsy embrionalne — poprzedzony
579