geny
2

tów lub całych genów (geny odniesienia jako kontrola). W technice tej stosuje się wiele par sond. Sondy zawierają, oprócz sekwencji docelowych komplementarnych do sekwencji ekso-nowych (sekwencje ulegające hybrydyzacji), sekwencje starterowe, a jedna z każdej pary dodatkowo unikatową sekwencję wstawki (ryc. 5).

Syntetyczny oligonukłeotyd 50-60 bp

M13-pochodny oligonukleotyd 60-450 bp

S&kwencjs prtmerowa x

Sekv/encja. prtmerowa Y

/

Wstawka unikatowa (różna w każcej sondzie)

Sekwencja ulegająca hybrydyzacji

Sekwencja ulegająca hybrydyzacji

Ryc. 5. Budowa sond w MLPA.

Sekwencje hybrydyzujące każdej pary sond wiążą się komplementarnie do sąsiadujących ze sobą fragmentów DNA i tylko przy w pełni komplementarnej hybrydyzacji może zajść ligacja (ryc. 6).

Po przyłączeniu sond do matrycy następuje ich ligacja, a następnie denaturacja, Oddy-socjowana zligowana sonda zawierająca sekwencje startowe zostaje poddana amplifikacji w reakcji PCR. Obecność różnej długości wstawek pozwala na rozróżnienie produktów skierowanych na różne cele, a ilość produktu jest proporcjonalna do ilości sekwencji matrycowej, Każdy pik odpowiada produktowi amplifikacji zligowanej specyficznej pary sond (ryc, 7),

Różnice względne w wysokości bądź powierzchni piku wskazują na zmiany ilościowe (bądź czasami jakościowe) docelowej sekwencji sondy (ryc, 8).

Ryc. 8. Wynik elektroforezy próby badanej wskazujący na delecję eksonu 13.

Zaletą tej techniki jest niewielka ilość DNA wymagana do przeprowadzenia analizy i możliwość zastosowania nawet zdegradowanego materiału genetycznego. Najważniejszymi zaletami metody są prostota wykonania, niska cena i małe wymagania co do ilości (20 ng ge-nomowego DNA) i jakości DNA. Oferowane gotowe zestawy sond dotyczą najważniejszych znanych genów silnie predysponujących do nowotworów takich jak: ATM, BRCA1, BRCA2, CHEK1, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, APC, FANCA, FANCD2, PTCH, BMPR1A, SMAD4, TP53, CDH1, MEN1, NF1, NF2, STK11, SMARCB1, RB 1, CDKN2A CDKN2B, WTł.