img146

nych dwu kringlach. Przekształcanie proenzymu jest bardzo wydajne, kiedy plaz-minogen i aktywator są umiejscowione na powierzchni fibryny. Zarówno aktywacja plazminogenu, jak i przebieg enzymatycznej degradacji substratów, przede wszystkim fibryny i fibrynogenu (fibrynogenoliza), w warunkach fizjologicznych są kontrolowane przez liczne inhibitory (tab. 12.5 i rys. 12.20). Jednym z najważniejszych jest a₂-anty-plazmina, która bezpośrednio hamuje aktywność enzymu. Inhibitor jest glikoproteiną o m. cz. 67 kDa, zaliczaną do rodziny serpin (inhibitory proteaz serynowych). Równie ważnym białkiem ograniczającym aktywność plazminy jest a₂-makroglobulina.

Dalszymi czynnikami, które pośrednio hamują aktywność plazminy, są tzw. inhibitory aktywatora plazminogenu: PAI-1 i PAI-2. Pierwszy jest glikoproteiną o m. cz. 52 kDa, zbudowaną z 379 aa i zawierającą centrum aktywne w regionie Arg 346/Met 347. Białko PAI-2 występuje w dwóch formach o m. cz. 47 i 60 kDa, przy czym ta ostatnia jest glikozylowana. W obu miejsca reaktywne znajdują się w okolicach: Arg 346/Met 347 łańcucha peptydowego.

Fibryno(geno)liza skrzepu fibryny i fibrynogenu. Rozpuszczanie skrzepu fibryny bądź rozpad cząsteczki fibrynogenu, polegające na atakowaniu wiązań wrażliwych na enzym, prowadzą w obu przypadkach do pojawiania się końcowych produktów degradacji plazminowej (FDP — fibrinogen/fibrin degradation products) uwarunkowanych rodzajem substratu. W przypadku fibrynogenu końcowymi składnikami procesu fibrynolizy są: centralna globula (E) o in. cz. ok. 50 kDa i 2 skrajne (D) o m. cz. 90 kDa każda. Występują one zwykle w postaci kompleksu DD/E połączonego wiązaniami wodorowymi. Oba rodzaje tych fragmentów mają określone właściwości biologiczne, np. E hamuje aktywność trombiny, a D ogranicza tempo polimeryzacji monomerów fibryny i jej zasięg. W przypadku rozpuszczania skrzepu fibryny stabilizowanej również pojawiają się fragmenty E o nieco mniejszej masie cząsteczkowej niż w przypadku fibrynogenu, z tym jednak, że fragmenty D są zastąpione dimerami D (D-D) o m. cz. 160-180 kDa. Oprócz tych ściśle zdefiniowanych plazminowych produktów rozpadu pojawia się w środowisku inkubacyjnym cała gama pośrednich peptydów o charakterze oligomerów bądź polimerów (X, DDE, DY, YY). Wszystkie omówione produkty rozpadu fibryny stabilizowanej określane są jako: XL-FDPs (cross-linking fibrin degradation products) (rys. 12.14 b). Najbardziej wrażliwym peptydem w przypadku działania plazminy na cząsteczkę fibrynogenu jest łańcuch Aa.

Z tego względu w pierwszej kolejności dochodzi do odłączania od niego w krótkim I czasie kilku drobnych peptydów o łącznej masie cząsteczkowej 20-25 kDa. W drugiej I kolejności następuje odszczepienie peptydów o m. cz. 4 kDa od łańcuchów B/7. Natywna cząsteczka fibrynogenu zostaje w ten sposób przekształcona w intermediaty X o m.cz. ok. 250 kDa. Teraz dochodzi do asymetrycznego przecięcia cząste i wytworzenia 2 fragmentów: Y (150 kDa) i D (90 kDa). W następnej fazie fragmeu Y ulega rozpadowi pod wpływem enzymu do składowych E i D. W efekcie wyczer pującej proteolizy plazminowej uzyskuje się z każdej cząsteczki fibrynogenu 1 frag ment E i 2 fragmenty D (rys. 12.14 b). Jeżeli hydrolizę przeprowadza się w warunka doświadczalnych i wychwyci się jony wapnia ze środowiska, np. za pomocą EDTA, fragment D, zwany też Dj lub ciężkim, ulega dalszej degradacji enzymatyc

(skrócenie łańcucha y) do wartości 80 kDa i pojawienia się fragmentu lekkiego (D₃). Ta utrata masy cząsteczkowej przez fragment Dj ma swoje odzwierciedlenie również we właściwościach biologicznych. Pierwszy hamuje polimeryzację monomerów fibryny, drugi — nie. Wynika to z faktu, że w końcu C łańcucha peptydowego y znajdują się miejsca polimeryzacyjne „a”, których brak we fragmencie D₃, a które są odpowiedzialne za oddziaływanie z odpowiednimi miejscami polimeryzacyjnymi „A” ulokowanymi w N-końcowej części natywnej cząsteczki fibrynogenu.

Znaczenie praktyczne produktów degradacji plazminowej. Produkty plazminowej degradacji fibrynogenu (FDP) jak i fibryny stabilizowanej (XL-FDPs), a szczególnie dimery D—D, mają duże znaczenie z punktu widzenia klinicznego. Wykorzystuje się je bowiem jako znaczniki do oceny stopnia powstawania zakrzepów naczyniowych w różnych stanach zaburzeń układu hemostatycznego oraz do identyfikacji niektórych jednostek chorobowych, np. zatorów płucnych, zakrzepów żył głębokich. Najlepszą z metod służącą do oceny poziomu dimerów D-D w osoczu jest immunologiczna technika ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay — test immunoenzymatyczny). Stężenie dimerów powyżej 500 ng/ml (500 gg/1), traktowane jako sygnał zakrzepicy, ma szczególne znaczenie w diagnozowaniu zatorów płucnych i zakrzepów żył głębokich. Stężenie mniejsze niż 500 ng/ml ma większe znaczenie praktyczne, gdyż prawie całkowicie wyklucza podejrzenia o stan zatorowy czy zakrzepowy.

12.5.5. Metody izolowania fibryny (fibrynogenu) oraz badanie właściwości fizykochemicznych i biologicznych tych białek

Ćwiczenie 12.52. Izolowanie fibrynogenu z plazmy według metody Doolittle’a

(R.F. Doolittle i wsp. 1973: Arch. Biochem. Biophys., 118:456-467)

Zasada: Białka osocza frakcjonuje się w niskiej temperaturze za pomocą roztworu etanolu o różnym stężeniu. Frakcję końcową zawierającą ok. 90% fibrynogenu oczyszcza się dodatkowo poprzez wysolenie tego białka siarczanem amonu (26% nasycenia). W ten sposób udaje się otrzymać preparaty o zdolności do krzepnięcia 95-98%.

Materiał: Świeża krew ludzka, świńska lub bydlęca wprowadzona do 3,2% roztworu cytrynianu sodu w stosunku objętościowym 9:1.

Odczynniki:

1)    1 obj. 95% etanolu i 1 obj. 0,055 M roztworu cytrynianu sodu (16,177 g C₆H₅0₇Na₃ • 2H₂0 rozpuścić i uzupełnić wodą do 1000 ml) o pH 7,0.

2)    1 obj. 95% etanolu i 11,5 obj. 0,055 M roztworu cytrynianu sodu (pH 6,4).

3)    0,055 M roztwór cytrynianu sodu (pH 6,4).

4)    1 obj. etanolu absolutnego i 6,6 objętości 0,055 M roztworu cytrynianu sodu (pH 6,4).

5)    1 obj. etanolu absolutnego i 4 obj. 0,055 M roztworu cytrynianu sodu (pH 6,4).

6)    0,055 M roztwór cytrynianu sodu (pH 7,0).

7)    Nasycony roztwór (NH₄)₂S0₄.

Uwaga: Wszystkie odczynniki należy przechowywać w temp. 4 C z wyjątkiem odczynnika 3 (temp. pokojowa); pH poszczególnych odczynników doprowadzić za pomocą 1 M roztworu HC1.

Wykonanie: Krew cytrynianową odwirować (wirówka K-70, 2500 obr./min, przez 30 min). Osadzone elementy morfotyczne odrzucić. Do 1 litra plazmy ochłodzonej do temp. 4°C dodać 215 ml zimnego odczynnika 1; mieszając doprowadzić do temp. -3°C. Pozostawić w tej temperaturze przez 30 minut. Całość odwirować (wirówka K.-70, 2500 obr./min, temp. — 3°C przez 20 min). Dodać 550 ml ochłodzonego

645