Wykład VI
Kwasy nukleinowe - liniowe polimery
Składa się z 2'-deoksyrybonukleotydów
Purynowe A, G, pirymidynowe C,
Zasada + cukier = nukleozydy (adenozyna, guanozyna, cytydyna, tymidyna
Dołączamy fosforan w pozycji 5' -> nukleotyd
Kwas 2'-deoksyryboguanylowy
Kwas 2'-deoksyryboadenylowy
- cytydylowy, - tymidylowy
Zasada pirymidynowa przez N1., purynowa przez N9. połączona jest wiązaniem N-glikozydowym z cukrem z C1'.
Cukier w DNA to 2'-deoksy-β-D-ryboza (rybofuranoza). 4 atomy C i tlen O4'.
Β, D - oznaczenia wynikające ze stereoizomerii. C1' i C4' to węgle asymetryczne, mają 4 różne podstawniki, cząsteczka nie pokrywa się ze swoim odbiciem, ma 4 różne diastereoizomery (izomery optyczne).
Stereoizomery L i α nie pojawiają się w DNA, bo enzymy są specyficzne do form izomerycznych.
Diastereoizomery skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego liniowo w dwóch przeciwnych kierunkach.
Włączając nukleotyd do łańcucha tworzymy wiązanie fosfodiestrowe między C3', a C5', powstaje ukierunkowana nić. Wyróżniony kierunek od 5' do 3'. Sekwencja nukleotydów w tym kierunku - struktura I rzędowa łańcucha kwasu nukleinowego.
Tworzy się łańcuch fosfocukrowy, który nadaje kwasom nukleinowym własności kwaśne. Grupa OH w reszcie fosforanowej w warunkach fizjologicznych jest deprotonowana, występuje tlen z ładunkiem ujemnym. pK protonacji (pH, dla którego 50% tlenów jest obsadzonych protonem) wynosi 1-2. Swobodne nukleotydy mogą się dodatkowo deprotonować, bo mają dwie grupy OH. pK dla drugiej grupy wynosi ok. 6,5 - 7,5.
W roztworze nukleotydy będą więc miały deprotonowaną jedną grupę OH, a druga będzie zostawała w równowadze formy uprotonowanej i deprotonowanej.
Pojawienie się ładunku ujemnego powoduje, że jest on równoważony przez kation, który może być jednowartościowy K+, Na+ lub dwuwartościowy Mg+.
Kwasy nukleinowe absorbują promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie bliskiego ultrafioletu (180-300nm). Chromoforami (część cząsteczki, która oddziałuje z promieniowaniem elektromagnetycznym, w wyniku czego powstaje wzbudzenie elektronu) są zasady azotowe. Tak więc do badania kwasów nukl często wykorzystywane są metody spektroskopii absorpcyjnej. Widmo: na jednej osi długość fali, na drugiej molowy współczynnik ekstynkcji (intensywność promieniowania zaabsorbowanego przypadający na jednostkowe stężenie molowe i na długość drogi optycznej - zwykle 1cm). Widma poszczególnych nukleotydów składają się na jednen obraz widmowy całego fragmentu oligonukleotydowego, zależnie od składu będzie się nieco różniło. Ale generalnie podobny przebieg widma z maksimum absorpcji ok. 260 nm.
Synteza DNA - replikacja prowadzona przez polimerazy, które włączają nukleotydy w postaci trójfosforanów do łańcucha. Po włączeniu mogą ulegać modyfikacjom, przeważnie metyzacji, więc w DNA mamy nie tylko 4 cegiełki ale też ich pochodne, np., metylowe.
Synteza na zasadzie komplementarności w kierunku od 5' do 3'.
Dołączane 2'-deoksy-ATP, 2'-deoksy-GTP, 2'-deoksy-CTP i TTP (nie trzeba zaznaczać, że deoksy)
RNA
różnica w cukrze - ryboza (rybofuranoza)
Uracyl U - w pozycji 5 zamiast CH3 jest proton.
Cegiełki: kwas urydylowy, guanylowy, cytydylowy, adenylowy
Nukleozydy: urydyna, guanozyna, cytydyna, adenozyna
Własności jonizacji grup OH są bardzo podobne.
Wyróżniony kierunek od 5' do 3', kolejność nukleotydów - struktura I rzędowa
Częściej niż DNA jest modyfikowany.
Ze względu na funkcję, dzieli się na różne typy (też różniące się długością) :
mRNA - matryca do syntezy białek w procesie translacji
rRNA - w rybosomach
tRNA - transferowy; wiąże aminokwasy i podprowadza je do maszynerii translacyjnej
snRNA - odpowiedzialny za składanie mRNA w komórkach eukariotycznych (splicing)
mikrona - krótkie cząsteczki pełniące rolę regulatorową
RNA może być też materiałem genetycznym niektórych wirusów
RNA powstaje w procesie transkrypcji - synteza na matrycy nici DNA niosącej informacje genetyczną. Włączanie rubonukletydów na zasadzie komplementarności.
Własności pojedynczych nukleotydów przekładają się na własności kwasu. Zasadnicza cecha: płaska struktura. Należy zwrócić uwagę na układ protonów i wiązań podwójnych.
Adenozyna i cytydyna mają w pozycji C4 grupy aminowe NH2, podobnie jak guanozyna w pozycji C2. Takie ustawienie grup protonów i wiązań podwójnych, które nazywa się tautomerią sprawia, że dominującymi tautomeriami stają się tautomery typu amino dla tych trzech zasad.
Jeśli popatrzymy na protony i na grupy związane z tlenami, czyli występowanie tzw. tlenów ketonowych, dla urydyna grupa CO w pozycji 4, dla urydyny w pozycji 6; odpowiednio wtedy protony znajdują się przy sąsiednich azotach; taką tautomerię nazywamy tupy keto lub okso.
Jeżeli dokonamy przeniesień protonów w inne miejsca i przeorganizujemy układ wiązań podwójnych, możemy otrzymać inne struktury tautomeryczne tych samych zasad, tzw. tazutoerów rzadkich, tj. imino i hydroksy lub enolo
Te odmienne tautomery mogą komplementować z innymi zasadami niż tautomerów zasadniczych. Zagadnienie tautomerii może być kluczowym zagadnieniem jeśli chodzi o właściwości kw nukl.
Watson i Crick:
Błędne parowanie - mutacje punktowe, może być inicjowane przez występowanie rzadkich tautomerów.
Ta hipoteza powstawania mutacji przez tzw. tranzycie została uzupełniona o powstawanie transwersji przez parowanie typu puryna-puryna.
Ilość rzadkich form musi być większa albo porównywalna z częstością zachodzenia mutacji, aby prawidłowo tłumaczyć inicjacje mutacji punktowych w oparciu o rzadkie formy tautomeryczne.
Problem tautomerii nie jest do końca wyjaśniony. Metody doświadczalne nie pozwalają wyznaczyć ilości tautomerów rzadkich bezpośrednio jeśli jest ich mniej niż 1%. Górną granicą ich ilości, która można określić doświadczalnie jest rzędu 10-2. Częstość mutacji punktowej bez korekcji enzymów naprawczych wynosi 10-4. Czyli jedna para niekomplementarna na 10000 powstaje w wyniku nieprecyzyjnego działania replikacji. Enzymy naprawcze redukują ilość mutacji do ok. 10-9, 10-12.
Jednak w pewnych warunkach możemy te formy wykrywać.
W badaniach widm podczerwini w tzw. matrycach niskotemperaturowych okazało się, że 9-metyloguanina występuje w 50% w formie keto i formie enolowej. Podobne badania dla cytozyny pokazują, że obok dominującej formy aminowej może wystąpić w formie iminowej w ilości nie przekraczającej 10%.
Niestety okazało się, że adenozyna, urydyna i tymidyna występują wyłącznie w formach dominujących - amidowej i ketonowej i że ich ilość jest na pewno mniejsza niż 10-10.
W tej metodzie tylko dwie z 4 zasad wykazują znaczący udział rzadkich tautomerów. Ponadto obserwuje się bardzo silną zależność równowagi tautomerycznej od warunków środowiska. Ponadto przy parowaniu równowaga tautomeryczna może się przesuwać.
Trudno więc udowodnić, że za powstawanie mutacji punktowych odpowiedzialne są rzadkie tautomery.
Zasady mają też możliwość przyłączania i odłączania protonów zależnie od pH. pH protonacji przy dysocjacji protonów zasad kwasów nukl wypadają ok. 2,5; 3; 3,5 jednostki poniżej pH fizjologicznego(7,2). Dysocjacja protonów dla guanozyny i urydyny zachodzi w pH 9,5-10; protonacja adenozyny na azocie N1 i cytozyny na N3 zachodzi w pH 4,5. Prawdopodobieństwo wystąpienia formy uprotonowanej, czy dysocjowanej w pH fizjologicznym wynosi 10-3, 10-4, czyli mniej więcej na granicy występowania mutacji punktowych. Sformułowano więc hipotezę, że uprotonowane lub zdysocjowane formy zasad nukleinowych są odpowiedzialne za inicjację mutacji punktowych.
Za hipotezą rzadkich tautomerów przemawia to, że możliwa jest chemicznie indukowana mutageneza. Pochodne zasad kw nukl często wykazują własności tautomerii i jedna z form tautomerycznych paruje z jedną zasadą komplementarną, a inna z inną.
Trzecia hipoteza:
Parowanie niekomplementarne pomimo, że ma wyższą energię, co jakiś czas zachodzić może. Np. parowanie GT nie ma dużo większej energii, a w RNA parowanie GU jest dopuszczalne (kodon-antykodon)
Konformacja poszczególnych nukleotydów
Warunkuje konformacje lokalną (strukturę II rzędową) i globalną (III rzędową) cząsteczki DNA czy RNA. Nukleotyd może występować w postaci wielu różnych konformerów wynikających z obrotu wokół wiązań pojedynczych. Jest strukturą giętką konformacyjnie - w roztworze w normalnych temperaturach mamy równowagę dynamiczną różnych konformerów i zależnie od ich energii różny jest procentowy udział. Oznaczenia konformerów dokonuje się na podstawie reguł ustalonych przez komisję nomenklaturową. Rzut Limanowa X ---- C --- C ----X (X-podstawnik). Możemy kręcić wokół wiązania środkowego i opisywać położenie poprzez podanie wartości kąta dwuściennego.
Ustawienie dwóch podstawników w wyniku obrotu wokół wiązania pojedynczego, możemy określać jako cis, czyli jeden X dokładnie za drugim (kąt 0 st). Może to też być ustawienie typu anti (180 st) odpowiadające ustawieniu trans. Możliwe są ponadto ustawienia kątami +60 st (+SP; dawne droit) i -60 st (-SP; dawne gauche). Oddziaływanie +sp i -sp i anti są najkorzystniejsze energetycznie.
Możliwości występowania różnych konformacji nukleotydów:
I Zasada może być różnie ustawiona ze względu na obrót wokół wiązania glikozydowego; kąt χ (hi) definiuje się przez atomy O4', C1', N1 lub N9 (zależy czy to puryna czy pirymidyna) i C4 lub C2. Przyjmuje się, że możliwe są 2 ustawienia zasady:
syn - kiedy pierścień leży nad płaszczyzną cukru
anti - obrót o 180 st
Kąt χ od -90 st do +90 st - mówimy o konformacji syn; poza tym anti
W roztworze zachowana równowaga dynamiczna. Obie formy występują.
II Konformacja pierścienia cukrowego. Nie jest płaski; może być w formie kopertowej E (envelope), gdy jeden atom jest wychylony z płaszczyzny pozostałych czterech; lub w formie listowej T, gdy dwa atomy są wychylone, jeden w jedną, drugi w drugą stronę. Możliwe są też konformacje pośrednie.
W roztworze równowaga dynamiczna dwóch form: formy N lub S, zależnie od tego czy wychylenie jest w górę, czy w dół.
N - atom C3' wychylony w górę; C3'endo 3E
S - atom C2' wychylony w górę; C2'endo 2E
Wychylenie endo - w górę lub egzo - w dół.
Konformacja wokół wiązania C4' - C5':
Możliwe 3 ustawienia tlenu O5' w stosunku do tlenu pierścieniowego i do węgla C3'
+Sc - skręt o 60 st
-sc - skręt o kąt -60 st
Ap - antiperiplanet
III Konformacja fosforanu
Grupę fosforanową można przypisać zarówno węglowi C5' jak i C3', patrząc na łańcuch nie da się określić do którego nukleotydu należy dana grupa.
Konformację w 5' nukleotydach określa kąt β, dominująca jest konformacja typu ap.
W 3' fosforanach dominuje konformacją z kątem 220, który nazywamy kątem ε.
Przy tworzeniu łańcucha konformację poszczególnych nukleotydów (a więc i całego łańcucha) opisują kąty γ, kąty pierścienia cukrowego, kąt ε oraz kąty α i β, które wynikają z włączenia nukleotydów w łańcuch (pojawiają się dwa nowe wiązania) oraz kąt χ i konformacja kątowa pierścienia cukrowego.