84763

zastanówmy jakie mogą być produkty. Mogą być produkty, które zwierają nici metylowane -to będą pewnie jako pierwotne cząsteczki, jakie włożyliśmy do układu. Większość produktów będzie pozbawiona metyzacji - to będą te cząsteczki które poprzez PCR będą syntezowane w przerażającej większości. W sensie eksperymentu metylacyjnego nas interesują tylko cząsteczki bez metylacji, zatem należy pozbyć się produktów metylowanych. Pozbywamy się ich, traktując preparat enzymem dpnl. Dpnl jest enzymem restrykcyjnym, który trawi tylko te sekwencje DNA, które są metylowane. Zatem metylowane cząsteczki DNA zostaną sfragmentowane, podzielone na krótsze fragmenty, których jest dużo, bowiem jest dużo miejsc metylacji w plazmidzie. Taki plazmid sfragmentowany nie będzie transformował efektywnie komórek bakteryjnych, a nawet jakby się tak zdarzyło, to te fragmenty nie będą replikowały w komórkach. Z wydajnością 99% dostaniemy klony z wprowadzoną mutacją. Przez oligonukleotydy można wprowadzić wiele mutacji na raz, dokonać delecji, insercji. Na tym polega metoda, w której wykorzystujemy fakt, iż DNA jest piętnowany w komórce bakteryjnej przez metylację.

Kolejna metoda wykorzystująca PCR do generowania mutantów opiera się na 2reakcjach. Nie jest to jednak metoda mega primera (bowiem ta wykorzystująca megaprimer jest użyteczna tylko jeżeli miejsca restrykcyjne nie są zbyt odległe. Jeżeli są natomiast bardzo odlegle, pojawiają się problemy związane z bardzo dużym megaprimerem).

Korzysta się z metod alternatywnych. Jedna z nich, przedstawiona na schemacie jest bardzo prosta.

Otóż widzimy sekwencję, do której musi być wprowadzona mutacja. W pierwszym etapie dzielimy sekwencję na 2fragmenty, mamy 2 startery i wykonuje się 2reakcje PCR. W jednej nici wprowadzana jest mutacja po prawej stronie fragmentu lewego czyli na 3'koncu i po lewej stronie fragmentu prawego czyli na 5'koncu też jest mutacja. Oba produkty ze sobą hybrydyzujemy. Produkt ma 2 wolne końce 3', więc po zastosowaniu polimerazy i reakcji PCR otrzymujemy produkt PCR.