87626

Obniżoną wydajność reakcji powiązaną z zanieczyszczonymi próbkami DNA możemy znieść przez:

-zwiększnie ilości jednostek enzymu dodanego do mieszaniny reakcyjnej

-zwiększenie objętości mieszaniny reakcyjnej w celu rozpuszczenia potencjalnych inhibitorów

-zwiększenie czasu inkubacji

Niektóre próbki DNA (często miniprepy) mogę być zanieczyszczone DNazami, które wymagają jonów Mg2+ do swojej aktywności. Takie próbki przechowuje się w buforze zawierającym EDTA

Trawienie genomowego DNA może być ułatwione poprzez dodanie polikationu spermidyny, która wiąże ujemnie naładowane zanieczyszczenia.

Aktywność gwiezdna

Obniżenie lub zanik specyficzności działania enzymów restrykcyjnych objawiające się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne; nazwa pochodzi od oznaczenia alternatywnej aktywności znakiem *, np. EcoRI*

Czynniki wpływające na pojawienie się aktywności gwiezdnej:

-    wysokie stężenie glicerolu - zmienia stałą dielektryczną środowiska

-    nadmiar enzymu w stosunku do DNA

-    wydłużony czas inkubacji

-    niska siła jonowa - im wyższa siła jonowa tym mniejszy wpływ oddziaływań elektrostatycznych (niespecyficznych)

-    obecność odczynników organicznych, np. DMSO, etanol, glikol

-    zastąpienie jonów Mg2+ innymi dwuwartośdowymi, np. Mn2+

-    wysokie pH (>8)

W przypadku aktywności gwiezdnej dodatkowe prążki DNA w żelu będą znajdowały się poniżej oczekiwanego prążka, nie powinno być żadnych dodatkowych prążków powyżej największego spodziewanego prążka.

Jednostka aktywności-jedna jednostka endonukleazy restrykcyjnej to ilość wymagana do całkowitej hydrolizy 1 ug testowego DNA w dągu 60 min w całkowitej maksymalnej objętości reakcyjnej-50 ul w warunkach optymalnych podanych przez producenta.

Przechowywanie

Wszystkie enzymy przechowujemy w -20C oprócz Hinl II, który jest bardziej stabilny w -70C

Izoschizomery-endonukleazy rozpoznające tę samą sekwencję. Mogą lub nie dąć DNA identycznie produkując te same końce. Mogą produkować końce kompatybilne:

BamHI

5'-G|GATCC-3'

3-CCTAG|G-5'

Bg/il

5'-A|GATCT-3'

3'-TCTAG|A-5'