Spis treści
6.1.6.2 Startery do identyfikacji i amplifikacji sekwencji intronów jhbp 53
6.1.6.3 Oligonukleotydy wykorzystywane w eksperymentach EMSA 56
6.1.6.4 Startery do amplifikacji fragmentów promotora do testów z genem 56 reporterowym
6.1.6.5 Startery do reakcji sekwencjonowania 57
6.2.2 Oznaczanie stężenia DNA i RNA 57
6.2.3 Izolacja genomowego DNA 58
6.2.4 Izolacja całkowitego RNA 59
6.2.5 Reakcja łańcuchowa polimerazy 61
6.2.6 Klonowanie produktów po PCR 61
6.2.7 Kontrola poprawności klonowania 62
6.2.7.1 Selekcja klonów metodą a-komplementacji 62
6.2.12 Selekcja klonów poprzez mini-preparację 62
6.2.8 Izolacja i oczyszczanie DNA z żelu agarozowego 63
6.7.9 Izolacja plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych 63
6.2.9.1 Izolacja plazmidowego DNA z mini-hodowli 63
6.2.9.2 Izolacja plazmidowego DNA do sekwencjonowania 64
6.2.9.3 Izolacja plazmidowego DNA z hodowli 64
6.2.10 Sekwencjonowanie DNA 65
6.2.10.1 Sekwencjonowanie DNA z wykorzystaniem znakowanych 65
starterów
6.2.10.2 Sekwencjonowanie DNA z wykorzystaniem znakowanych 65
di deoksy nukl eoty dów
6.2.11 Amplifikacja sekwencji promotora metodą Genome Walking 66
6.2.12 Identyfikacja miejsca startu transkrypcji 67
6.2.13 Testy z genem reporterowym 68
6.2.13.1 Hodowla komórek linii HighFive 68
6.2.13.2 Transfekcja komórek i odczyt aktywności lucyferazy 68
6.3 Programy komputerowe i bazy danych 69
7 Wyniki 70
7.1 Poznanie sekwencji i struktury genu jhbp z G. mellonella 71
7.1.1 Próby znalezienia sekwencji promotora jhbp oraz poznania ilości kopii 71 genu w genomie
7.1.2 Spacer po genie, czyli poznanie sekwencji promotorowej 74
7.1.3 Sekwencje i położenia intronów 78
7.1.4 Miejsce startu transkrypcji 81
7.2 Analiza sekwencji genu jhbp. W poszukiwaniu miejsc regulatorowych 83
7.2.1 Poszukiwanie sekwencji regulatorowych w genie jhbp poprzez bazy 83 danych zawierające znane elementy regulatorowe
7.2.2 Analiza sekwencji promotora rdzeniowego 85
7.2.3 Na tropach historii genu 86
7.2.3.1 Pozostałości ewolucyjne w genie jhbp 86
7.3 Wyniki EMSA uzyskane na potencjalnych sekwencjach wiążących 89
białko Usp
4