2906542979

204 A. PRZYKORSKA [71

lizują zarówno natywne jak i termicznie zdenaturowane polimery d (AT). Johnson i wsp. (8) wykazali, że nukleaza z fasoli złocistej tylko dwukrotnie wolniej hydrolizuje natywny aniżeli zdenaturowany termicznie, biosyntetyczny polimer d(AT)n niezawierający par GC. Gdy substratem jest d(AT)n z kraba, gdzie około 3% stanowią pary GC preferencja wobec zdenaturowanej termicznie formy wynosi 65 razy, a w przypadku DNA faga T₄, gdzie par GC jest jeszcze więcej (około 34%) enzym aż 30 000 razy szybciej hydrolizuje formę jednoniciową. W tych warunkach nie stwierdzono hydrolizy poli dG*poli dC nawet przy 10-krotnym nadmiarze enzymu. Szybka hydroliza natywnego poli d(AT) jest prawdopodobnie również odzwierciedleniem specyficzności nukleazy wobec struktur jednoniciowych, gdyż stopień hydrolizy poli d(AT) wzrasta gwałtownie w warunkach sprzyjających częściowej denaturacji, a więc w niskiej sile jonowej i w niskim pH. W przypadku biosyntetycznego d(AT)n wysoka wartość współczynnika temperaturowego reakcji (Q10) w zakresie temperatur 27—37°C również wskazuje, że enzym rozpoznaje rozluźnienie drugorzędowej struktury polimeru występujące bezpośrednio przed jego stopnieniem (Tm = 46°C) (8). Zmiany w konformacji poprzedzające topnienie udowodniono stosując pomiary wiskozymetryczne (46).

Z drugiej strony stabilizacja struktury drugorzędowej polimeru, na przykład pod wpływem jonów Mg²⁺, wpływa na obniżenie szybkości hydrolizy d(AT)n (8).

111-2. Działanie na natywny, kolisty DNA o strukturze superhelikalnej

Brak kwasorozpuszczalnych nukleotydów wśród produktów hydrolizy znakowanego węglem radioaktywnym DNA plazmidu Col El i DNA plazmidu kryptycznego z nukleazą z nukleoplazmy jąder zarodków żyta (17) wskazuje, że badane kwasy nukleinowe nie są hydrolizowane przez enzym. W dalszych badaniach (17) okazało się jednak, że nukleaza ta może atakować w specyficzny sposób natywny, kolisty DNA. Na przykład kolisty DNA o strukturze superhelikalnej plazmidu Col El lub faga PM2 w pierwszym etapie reakcji przekształcany jest przez enzym w zrelaksowaną formę kołową, a następnie w formę liniową o długości odpowiadającej całkowitej długości chromosomu (Hyc. 3). Powstająca cząsteczka liniowa nie posiada prawdopodobnie lepkich końców, lub są one bardzo krótkie, gdyż denaturują bez uprzedniego ogrzewania. Pierwszy etap reakcji jest stosunkowo szybki. Po godzinnej inkubacji DNA plazmidu Col El z enzymem wśród produktów reakcji brak jest już formy superspiral-nej, a 83% DNA występuje w postaci zrelaksowanej formy kołowej. Formy liniowej jest tylko około 17%. Przedłużenie czasu inkubacji nie powoduje pojawiania się dalszych produktów degradacji. Obserwuje się jedynie powstawanie formy liniowej kosztem formy kolistej. Ten etap reakcji przebiega jednak powoli tak, że po 6,5 godzinach inkubacji forma