3893820135

Dzień 1. Izolacja białek z materiału roślinnego (ok. 3 h)

Metody stosowane do izolacji i oczyszczania białek zależą od ich właściwości. Poniżej, podano procedurę izolacji histonów rdzeniowych. Należy jednak pamiętać, że obok histonów metodą tą ekstrahuje się również wiele innych białek. Materiały:

-    zamrożony materiał biologiczny (komórki hodowane w pożywce MS z 0,1% i 3% sacharozą)

-    ciekły azot

-    lód

-    probówki wirówkowe na 30 ml lub falkony 50 ml

-    duża wirówka z chłodzeniem

-    kołyska laboratoryjna

-    moździerze i tłuczki

-    homogenizator IKA

-    włóknina „Miracloth”

-    suszarka (zimny strumień powietrza)

-    waga laboratoryjna

-    pęseta Odczynniki:

-    2M Tris-HCl pH 7,5

-    0,5M EDTA pH 8.0

-    36-38% HC1 (11,46M)

-    2-merkaptoetanol (14,2 M)

-    bufor HI (Histone Isolation):

Mn 10 mM Tris-HCl pH 7.5 \y 2 mM EDTA

0,25 M HC1

5 mM 2-merkaptoetanol*

* dodać nie wcześniej niż 30 min. przed izolacją

-    100% TC A

-    5x SDS loading buffer (60 mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, bez Bromophenol Blue)

-    5x SDS loading buffer z barwnikiem - 0.025% Bromophenol Blue

-    1MDTT

-    zimny aceton (-20°C)

W trakcie izolacji nie należy ogrzewać materiału, trzeba dbać o utrzymanie niskiej temperatury poprzez trzymanie próbek w lodzie lub pracę w chłodni. Wszelkie wirowania należy przeprowadzać w schłodzonej do 4°C wirówce.

Pierwszym etapem jest homogenizacja komórek w celu uwolnienia białek. Następnie białka wytrącane są kwasem trój chlorooctowym (TCA). TCA usuwany jest z osadu białek poprzez płukanie zmrożonym acetonem.

Wykonanie

1.    Utrzeć materiał roślinny zamrożony w ciekłym azocie w moździerzu porcelanowym na proszek (zarówno moździerz jak i tłuczek należy wcześniej schłodzić poprzez zalanie ciekłym azotem; ucieranie komórek z zawiesiny będzie łatwiejsze, jeżeli przed odwinięciem foli „obstukamy” ją zimnym tłuczkiem). Nie dopuścić do rozmrożenia materiału!

2.    Odważyć Ig utartego materiału i przenieść schłodzoną w ciekłym azocie szpatułką do probówki na 50 ml zawierającej 10 ml buforu HI (tuż przed izolacją dodać do buforu HI 2-merkaptoetanol).

3.    Zawiesinę dodatkowo homogenizować ok. 20 s homogenizatorem IKA przy najwyższych obrotach (należy pamiętać, że nóż homogenizatora trzeba dobrze opłukać przed i po homogenizacji (najlepiej trzymając pracujący nóż w plastikowej butelce z wodą destylowaną) i wytrzeć do sucha papierowym ręcznikiem; pracujące noże należy trzymać w roztworze).

4.    Próbki zrównoważyć i wirować przez 15 minut przy 12000 x g w plastikowych probówkach 30 ml.

5.    Supernatant przelać do falkonu na 50 ml przez jedną warstwę włókniny Miracloth.

^ 6. Dodać 100% TCA do końcowego stężenia 25%.

Uwaga: TCA jest substancją silnie żrącą, dodawać w rękawiczkach pod włączonym wyciągiem. Po pracy z TCA rękawice wyrzucić i założyć nowe.

7.    Pozostawić próbki w lodzie na co najmniej 30 minut na kołysce laboratoryjnej.

8.    Po zrównoważeniu prób żwirować przez 30 - 40 minut przy 16000 x g w szklanych 30 ml probówkach Corex (należy pamiętać

0    założeniu gumowych adaptorów na probówki).

9.    Wylać supernatant, zaznaczyć położenie osadu w probówce pisakiem wodoodpornym.

10.    Osad zalać 25 ml zimnego (-20°C) acetonu

1    odwirować przez 5 min. w warunkach jak powyżej. Pamiętać o zrównoważeniu próbek i umieszczeniu probówek tak, aby osad znajdował się na „na zewnątrz” od osi rotora. Dokładnie i delikatnie wylać nadsącz. Czynność powtórzyć.