3893820137

16 Biologia Molekularna Roślin

Wykonanie

1.    Przetrzyj szklane szybki i ceramiczne płytki metanolem lub acetonem.

2.    Włóż po bokach - pomiędzy szybkę a płytkę przekładki (rys.2) i umieść w statywie (casting clamp - rys.3). Wcześniej upewnij się, że na statywie nie zostały resztki zaschniętego akrylamidu.

3.    Dokręć śruby aż poczujesz lekki opór (zbyt mocne dociśnięcie może spowodować pęknięcie szybki).

4.    Wstaw do podstawki (casting cradle) i dociśnij do silikonowej gumy w podstawie poprzez przekręcenie do góry czarnych śrub.

W celu sprawdzenia szczelności układu można między szybki wlać wodę destylowaną. Po takim teście szyby należy dokładnie osuszyć bibułą.

5.    Przygotuj mieszaninę dla żelu rozdzielającego: fj^l2% żel rozdzielający:

^ - 3 ml mieszaniny monomerów (30% akrylamid, 0,8% bisakrylamid);    (3,75 ml dla 15%)

-    1,8 ml 1.5M Tris-Cl pH 8.8

-    75 pl 10% SDS

- 2,625 ml wody;    (1.88 ml dla 15%,)

-    75 pl 10% APS _ - 7,5 pl TEMED

-    APS i TEMED dodaje się tuż przed wylaniem mieszaniny pomiędzy szyby

6.    Od razu po dodaniu katalizatorów polimeryzacji roztwór dokładnie, ale delikatnie wymieszaj (unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza) i wiej pomiędzy przygotowane szybki pozostawiając 3-4 cm na żel rozdzielający.

7.    Nałóż warstwę (2-3 mm) nasyconego wodą butanolu i pozostaw do polimeryzacji na co najmniej 30minut.

8.    Delikatnie usuń butanol i osusz bibułą szybki.

9.    Wlej żel zatężający i włóż grzebień pomiędzy szybki. Grzebień trzeba umieścić tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powietrza. Żel j est gotowy do użycia po 20 - 30 minutach.

\y Żel zatężaiący:

9 - 0,65 ml mieszaniny monomerów

-    1.2 ml 0.5M Tris-Cl pH 6.8

-    120 pl 10% SDS

-    3 ml wody

150 pl 10% APS g*- 15 pl TEMED

Tak przygotowany żel można zapakować szczelnie w folię z kawałkiem mokrego ręcznika papierowego i przechowywać kilka dni w lodówce.

10.    Przed elektroforezą żel (wraz z szybami) umieszcza się w aparacie, przymocowując czerwonymi klipsami (rys. 4) i zalewa buforem elektrodowym (bufor SDS PAGE) - uwaga: przygotowany bufor jest 5 razy stężony.

11.    Po ostrożnym wyjęciu grzebienia z żelu należy pamiętać o przepłukaniu studzienek buforem SDS-PAGE. Należy także sprawdzić czy pomiędzy szybą a żelem nie znajdują się pęcherze powietrza, które uniemożliwią poprawny rozdział białek.

Przygotowanie próbek do naniesienia na żel

Uwaga: nie dotyczy standardu wielkości

12.    Odpipetować obliczoną wcześniej objętość każdej próbki wyizolowanych histonów do nowych podpisanych probówek. Ponadto odpipetować 5 pl komercyjnej mieszaniny histonów do nowej probówki. Do probówki tej dodać 1 pl buforu 5xSDS z barwnikiem.

13.    Inkubować preparaty przez 5 minut w 95°C -denaturacja białek.

14.    Krótko żwirować w mikrowirówce.

15.    Nanieść próbki oraz 5 pl standardu wielkości na żel za pomocą wydłużonych tipsów i rozpocząć elektroforezę.

Elektroforeza

Natężenie i napięcie, przy których prowadzona jest elektroforeza, są zależne od grubości, szerokości i długości żelu oraz naszych oczekiwań co do jakości i czasu rozdziału białek.

Zwykle zalecane jest stałe natężenie prądu w granicach 12-30 mA / żel grubości lmm i szerokości 10cm. W przypadku używanych na ćwiczeniach zestawów Hoeffer należy ustawić natężenie prądu 25 mA na 1 żel. 12% żel rozwijać do czasu aż czoło barwnika będzie wychodzić z żelu. W przypadku żelu 15% dobrze jest wydłużyć elektroforezę o ok. 10 minut. Przy doborze parametrów elektroforezy dla innej wielkości żeli należy pamiętać, że wraz ze wzrostem szerokości i grubości żelu można zwiększyć natężenie prądu. Jeśli żel jest dłuższy należy zwiększyć napięcie. Przy doborze napięcia i natężenia prądu należy zwracać uwagę na moc prądu, który będzie płynął przez żel (natężenie*napięcie). Parametr ten mówi ile ciepła będzie wydzielało się podczas elektreoforezy.