6161619719

zostanie przyłożona próbka materiału absorbującego promieniowanie, to wiązka promieniowania wnika w głąb próbki (fala zanikająca) na bardzo małą głębokość, zależną od kąta padania wiązki i współczynników załamania światła kryształu ATR i samej próbki. Część promieniowania może zostać zaabsorbowana przez próbkę, a mierząc intensywność promieniowania wiązki odbitej od powierzchni kryształu można uzyskać widmo charakterystyczne dla materiału próbki, tzw. widmo ATR.

Widma ATR są złożeniem widma refleksyjnego (odbiciowego) oraz absorpcyjnego. Korekcja ATR umożliwia wyodrębnienie części absorpcyjnej widma ATR. Korygowane są także efekty widmowe związane z niektórymi zjawiskami optycznymi, jak normalna lub anomalna dyspersja optyczna. W ich wyniku fale o różnych częstotliwościach penetrują warstwy próbki o różnej grubości, a co za tym idzie, są różnie przez nią absorbowane. Zjawisko to jest silnie zależne od współczynnika załamania światła próbki, dlatego też nie można dokonywać operacji odejmowania lub dodawania widm ATR próbek o różnych współczynnikach załamania światła.

W spektroskopii biocząsteczek najważniejszą zaletą techniki tłumionego wewnętrznego odbicia jest możliwość uzyskania widm roztworów, których składniki (przede wszystkim woda) posiadają bardzo silne pasma własne, uniemożliwiające uzyskanie widma samego białka metodą transmisyjną. Wadą tej techniki jest jednak konieczność stosowania dość wysokich stężeń biocząsteczek oraz konieczność korekcji tych widm, jeżeli mają one zostać poddane dalszej analizie.

5.4. Eksperymenty

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest obserwacja zmian zachodzących w strukturze drugorzędowej lizozymu z białka jaja kurzego, spowodowanych obecnością w roztworze substancji denaturującej: soli metalu ciężkiego lub kwasu nieorganicznego.

Przebieg ćwiczenia

Przygotowanie roztworów

Roztwory substancji denaturującej

1. Za pomocą biurety przygotować 12 roztworów substancji denaturującej o wzrastającym stężeniu. Rodzaj substancji oraz jej stężenia wskazuje osoba prowadząca zajęcia. Wszystkie rzeczywiste objętości roztworów wyjściowych oraz końcowych zapisać w tabeli wyników.

Roztwory lizozymu

1.    Do ponumerowanych probówek 1,5 ml odważyć na wadze analitycznej po ok. 50 mg wcześniej oczyszczonego i liofilizowanego białka. Masę białka w każdej z probówek zapisać w tabeli.

2.    Do kolejnych probówek dodać odpowiedni roztwór denaturanta tak, aby końcowe stężenie białka wynosiło 100 - 150 mg/ml roztworu denaturanta (dokładne stężenie końcowe białka podaje osoba prowadząca). Wszystkie objętości zapisać w tabeli wyników.

3.    Każdą próbkę zworteksować i odwirować przez ok. 30 sekund przy 6 tys. obrotów/min.

4.    Próbki pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej.