8009766946

ćwiczenie 2

Enzymy służące do modyfikacji DNA

Część teoretyczna

Obecnie stosuje się wiele różnorodnych, komercyjnie dostępnych enzymów służących do modyfikacji i rekombinacji DNA. Są to m in.: enzymy restrykcyjne (ćwiczenie 1), alkaliczna fosfataza (AP, ang. a/ka/ine phosphalase), kinaza polinukleotydowa, ligaza DNA, polimeraza DNA I, fragment Klenowa, nukleaza SI, odwrotna tran skry ptaza, terminalna transferaza, RNaza, DNaza, egzonukleazy (I, III), endonukleazy (IV, V), polimeraza DNA (Taq, Pfu), topoizomeraza.

Alkaliczna fosfataza (EC 3.1.3.1) jest hydrolitycznym enzymem odpowiedzialnym za usuwanie reszt 5’ fosforanowych z DNA, RNA oraz nukleotydów. Wszystkie alkaliczne fosfatazy są metaloenzymami (Zn(II)). Proces usuwania grup fosforanowych nazywany jest defosforylacjąi przebiega z wytworzeniem produktu pośredniego zawierającego ufosforylowaną serynę. Enzym ten wykazuje najwyższą aktywność w środowisku alkalicznym - stąd jego nazwa. Możemy wyróżnić kilka rodzajów alkalicznej fosfatazy, pochodzących z różnych źródeł, które odróżnia między innymi możliwość inaktywacji:

-    bakteryjna alkaliczna fosfataza (BAP - bacteria/ atkaline phosphalase) - wykazuje najwyższą aktywność i jest najbardziej trwała (najtrudniej ją inaktywować po zakończeniu reakcji defosforylacji). BAP jest wydzielana w postaci monomeru (M_r = 47 kDa) do przestrzeni peryplazmatycznej Escheńchia coli, gdzie dimeryzuje i staje się katalitycznie aktywna. W obojętnym lub alkalicznym pH, dimer BAP zawiera do 6 jonów Zn²⁺, z których dwa są niezbędne dla aktywności enzymu. Tylko jedno z dwóch miejsc katalitycznych dimeru jest aktywne przy niskim stężeniu sztucznego substratu, podczas gdy oba stają się aktywne przy wysokim stężeniu.

-    alkaliczna fosfataza z jelita cielęcego (CIAP - calf intestinal a!kalinę phosphalase) -najczęściej używana w laboratoriach biologii molekularnej. Wykazuje niewiele niższą aktywność w stosunku do BAP, a można ją efektywnie inaktywować termicznie lub poprzez trawienie proteolityczne. CIAP jest glikoproteiną zbudowaną z dwóch 514-aminokwasowych monomerów. Aktywność enzymu zależy od stężenia jonów Mg²⁺ i Zn²⁺. Zn²⁺ wiąże się w centrum katalitycznym i jest wymagany do aktywności katalitycznej. Mg²⁺ wiąże się do różnych miejsc enzymu i jest allosterycznym aktywatorem.

-    alkaliczna fosfataza z krewetek (SAP - shrimp alkaline phosphalase) - izolowana z krewetek Pandahis borealis, jest stosunkowo łatwa do inaktywacji termicznej.

Przy manipulacjach DNA alkaliczna fosfataza używana jest głównie do:

-    usuwania grupy 5 fosforanowej z plazmidów i wektorów bakteriofagowych, które uprzednio zostały strawione enzymami restrykcyjnymi (Ryc. 2.1). Zapobiega to ponownej cyrkularyzacji wektora, a tym samym wydajność klonowania jest większa (Ryc. 2.2).

-    usuwania grupy 5 fosforanowej z fragmentów DNA poprzedzającego radioaktywne znakowanie ²P (przygotowanie DNA do radioaktywnego znakowania w reakcji z wykorzystaniem polinukleotydowej kinazy faga T4) (Ryc. 2.1).

-    usuwania grupy 5'fosforanowej z RNA, rNTPs i dNTPs.

-    jako enzym reporterowy w nieradioaktywnych systemach do wykrywania i lokalizacji kwasów nukleinowych i białek. AP jest skoniugowana z ligandem, który specyficznie oddziałuje z cząsteczką docelową.

16