8009766956

redukcji napięcia powierzchniowego), BSA (ang. bovine serum albumin, albumina z grasicy cielęcej) zwiększa ogólne stężenie białka.

3.    Obecność zanieczyszczeń pozostałych po preparatyce izolacji DNA (EDTA, fenol, etanol, proteinazy itd.) może inaktywować enzym restrykcyjny.

4.    W wyniku zastosowania nieodpowiednich warunków reakcji może pojawić się niespecyficzna aktywność enzymu - tzw. star activity. Czynniki sprzyjające:

-    zbyt długi czas reakcji (zmiana stężenia buforu w wyniku odparowywania wody z mieszaniny reakcyjnej)

-    nieoptymalna temperatura reakcji,

-    zbyt wysokie stężenie enzymu,

-    nieoptymalne stężenie soli,

-    nieoptymalne pH,

-    obecność w mieszaninie reakcyjnej jonów Mn²⁺, zamiast Mg²⁺ (jony Mg²⁺ są niezbędne dla aktywności endonukleaz);

-    obecność rozpuszczalników organicznych,

-    zbyt wysokie stężenie glicerolu (enzymy przechowuje się w temp -20°C w 50% glicerolu jednak, aby enzym działał prawidłowo końcowe stężenie glicerolu nie powinno przekraczać 5%).

Endonukleazy restrykcyjne są wrażliwe na obecność zmetylowanej zasady w obrębie sekwencji DNA przez nie rozpoznawanej, co wyraża się nie rozpoznaniem jako substratu sekwencji docelowej. Zmetylowane zasady występujące w DNA to: N6-metyloadenina, N6mA, m⁶A), N4-metylocytozyna (N4mC, m⁴C) i 5-metylocytozyna (5mC, m⁵C) (Ryc. 1.4)

N6-metyloadenina N4-metylocytozyna 5mC -metylocytozyna

Ryc. 1.4 Zmetylowane zasady w DNA oraz kofaktor grup metylowych S-adenozylometionina (AdoMet).

7