• Onkogeneza i apoptoza, 17 maja 2004-05-17

Na czerwono - moje wątpliwości - do sprawdzenia, porównania z innymi itp.

Literatura:

B. Alberts, Molecular Biology of the Cell, Chapter: Cancer

BioEssays 26 (March 2004): 262?

Tutaj mam śliczny schemat (ten, do którego wracała wielokrotnie) a pod nim napisane:

A senescent phenotype can be induced in normal cells by many distinct signals. Replicative senescence results from prolonged proliferation in culture. Premature senescence can be induced by various damage or cellular stress signals and is independent of replicative age. In all cases the cell-cycle arrest is associated with the induction of CDKIs. In telomerase-negative cells, telomere is shortening and as a mitotic clock to define replicative capacity, Evidence for a telomere-independent-end cell-intristic mechanism of limiting replicative life span is currently under debate.

• Onkogeneza

Transformacja nowotworowa to nieuprawniona, wadliwa proliferacja wielokrotna komórki, która prowadzi do utworzenia klonu. Komórki dzielą się w sposób niekontrolowany.

Kontrola komórkowa naszego organizmu podlega tzw. starzeniu replikacyjnemu. Przy każdym podziale komórkowym następuje skrócenie telomerów. Całkowite odcięcie odcinka telomerowego to sygnał dla komórki do wejścia w apoptozę. Przybliżona liczba podziałów, po których to następuje wynosi według Heiflicka ok. 50-60 i nazywana jest stalą lub limitem Heiflicka. Komórki nowotworowe przekraczają ten limit i stają się nieśmiertelne (immortalizacja komórek) a odcinki telomerowe zostają odtwarzane dzięki aktywacji telomerazy.

Kontrola cyklu komórkowego następuje w punktach kontrolnych (checkpoints). Jednym z nich jest punkt kontrolny G1/S. Tu prawidłowe komórka są najbardziej wrażliwe na wszystkie czynniki, kierujące ją na ścieżkę apoptozy. Komórki nowotworowe natomiast nie reagują na te sygnały.

Czynniki sprzyjające proliferacji:

• Czynniki wzrostu (np.EGF = Epithelial Growth Factor). Występują one w ścieżce sygnalizacyjnej, mitogennej, która poprzez kaskady kinaz pozwala komórce na wejście w fazę G1. Prawidłowa komórka, która weszła na drogę różnicowania nie odpowiada na te sygnały. Komórka nowotworowa natomiast pomimo braku sygnałów ma włączona ścieżkę sygnalizacyjną, a więc stale obecny sygnał do wzrostu.

Każda zmiana w ścieżce sygnalizacyjnej to potencjalny nowotwór.

W ścieżce sygnalizacyjnej czynników wzrostu występują strażnicy genomu (antyonkogeny): p53 - produkuje inhibitor wejścia komórki w fazę S. Polega to na stymulacji cylkliny D do wiązania się z Cdk Rb - czynnik transkrypcyjny genów, które są potrzebne do replikacji. Uaktywniany jest przez fostorylację. Nadekspresja cykliny D powoduje defekt Rb i komórka wchodzi w fazę S.

p53  p21  p16 → Cdk→ cyklinaD  Rb→faza S  apoptoza

• Kinaza ATM - zatrzymuje podział komórki przy wejściu w replikację w przypadku nieciągłości DNA spowodowanej substancjami rakotwórczymi. Przy prawidłowej replikacji następuje cięcie DNA przez enzym topoizomerazę, która działa chwilowo, rozplata 2 nici, po czym je z powrotem łączy. Nie występuje nieciągłość.

• Antyonkogen antystresowy (PTEN) - nie pozwala komórce wejście w fazę S w sytuacjach stresowych np. działanie adrenaliny, szok termiczny, które mają tendencję do aktywacji ścieżki onkogennej. PTEN to ścieżka modyfikująca fosfatydyloinozy- tole znajdujące się w błonie komórkowej. Aktywacja antyonkogenu PTEN powoduje degradację p53.

Naświetlania - dobre czy złe?

Lecznicze naświetlania powodują duże ubytki w DNA, przez co alarmują i pobudzają ścieżkę ATM do działania. Po chemioterapii zwiększa się szansa na skierowanie komórki w apoptozę.

Guzy niezłośliwe powstają gdy mamy do czynienia ze zbalansowanym obniżeniem zdolności do wchodzenia w apoptozę z jednoczesnym zachowaniem możliwości wchodzenia w replikację. Naświetlanie powoduje wejście komórki w apoptozę.

Zjawisko progresji - z niezłośliwego guza tworzy się złośliwy, czyli taki, gdzie klon komórek transformowanych nie wchodzi w apoptozę nawet pod wpływem naświetlania.

proliferation

↑

Onkogen →pMyc──→Apoptosis

──Bcl-2

białko Myc - decyduje o rozpoczęciu proliferacji

Bcl-2 - onkogen, którego produkt przeciwdziała apoptozie

Przeciwciało cPNA (c Proliferation Nuclear Antygen) działa dzięki ufosforylowanemu białku Myc.

HIF1 - czynnik niedotlenienia. W momencie rozrostu guza dochodzi do niedotlenienia jego komórek oraz do ich obumarcia. Zapobiega temu HIF1, który wydziela na zewnątrz komórek fostatazy kwaśne, co powoduje aktywację czynnika angiogenezy oraz odżywienie niedotlenionych komórek. Innym skutkiem jego działalności jest dostanie się komórek nowotworowych do krwi oraz przerzut. Nowotwór niezłośliwy przekształca się w złośliwy.

Sukcesja nowotworu:

Łagodny → złośliwy→ przerzut

Cechy komórek nowotworowych:

1. Wchodzenie w cykl komórkowy bez czynników proliferacji

2. Niewrażliwość na inhibitory (antyonkogeny regulujące checkpoints)

3. Niestabilność genetyczna

4. Inwazyjność tkankowa i zdolność do przerzutów

5. Immortalizacja

6. Zdolność do podtrzymywania angiogenezy i czynnika HIV

7. Oporność na apoptozę

8. mutacyjne defekty w ścieżce sygnalizacyjnej międzykomórkowej regulowane antyonkogenem APC

9. mutacyjne defekty w ścieżce sygnalizacyjnej fosfatydyloinozyoli.

APOPTOZA

Historia badań nad apoptozą:

1966 - J.W. Saunders Jr. “śmierć jest niezbędna do eliminowania organów i tkanek podczas wczesnego rozwoju embrionalnego”

1972- J.F. Kerr et al. - apoptoza - „śmierć występująca naturalnie podczas rozwoju”

1991 - Ellis i Ch. Desei - białka indukujące apoptozę (proapoptyczne) i antyapoptyczne (ced-9 u drożdży???)

1992- M. Hengertner - odkrył Bcl-2 (homolog ced-9 u człowieka)

2002 - S. Breuner (UK), H.R.Holwitz (USA), J.E. Sulston (UK) - nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny za genetyczną regulację rozwoju i PCD

PCD (Programmed Cell Death) = apoptoza u zwierząt

PCD - kontrolowana i regulowana genetycznie forma śmierci komórki organizmu wielokomórkowego. Komórki biorą aktywny udział w procesie własnej śmierci - jest to „śmierć samobójcza”.

Nekroza - niekontrolowana śmierć, następuje wskutek uszkodzenia komórki, prowadzi do jej lizy oraz stanu zapalnego komórek sąsiednich.

Zdjęcie: Komórka trofoblastu podczas apoptozy

MAŁE PRZYPOMNIENIE (ja nie miałam zoologii):

Trofoblast, komórki grupujące się w części zewnętrznej kosmówki (błony płodowe), tworzące początkowo litą warstwę, następnie różnicującą się na zewnętrzny syncytiotrofoblast i wewnętrzny cytotrofoblast, w którym tworzą się zawiązki naczyń.

Trofoblast zaczyna się kształtować jeszcze przed zagnieżdżeniem się jaja płodowego, w wyniku różnicowania się jego komórek. Komórki trofoblastu wrastają w zmienioną ciążowo błonę śluzową macicy (doczesną) i dzięki enzymom litycznym nadżerają jej naczynia krwionośne, skąd czerpią substancje odżywcze dla zarodka, a później płodu.

Układają się w tzw. sznury, ze sznurów zaś trofoblastu powstają kosmki pierwotne, które z kolei przekształcają się w ostateczne kosmki, spełniające rolę odżywczą. Kosmki pierwotne są zasadniczym elementem strukturalnym i funkcjonalnym zarówno kosmków, jak i łożyska.

Przejawy apoptozy przeciwstawione procesom nekrozy
	Apoptoza	Nekroza
...	Pojedyncze komórki	Grupy sąsiadujących komórek
	Skurczenie fragmentacja	Puchnięcie, pęcznienie
Błona komórkowa	Zachowana ciągłość Tworzenie pęcherzyków, dających początek ciałkom apoptotycznym (Membrane is being blebbed.) Fosfatydyloseryna na powierzchni	Przerywanie ciągłości, rozrywanie, brak
Mitochondria	Zwiększona przepuszczalność błon Uwolnienie cytochromu c do cytoplazmy przez Apaf-1 (białko o typie proteazy) Zachowana struktura	Pecznienie Zaburzona, nieuporządkowana??? struktura (disordered structure)
Jądro		Rozproszenie otoczki jądrowej
Chromatyna	Kondensacja chromatyny Internukleosomalna fragmentaja DNA przez odpowiednie endo?nukleazy	Fragmentacja DNA przypadkowa (w przypadkowych miejscach)
Degradacja komórki	Fagocytoza Brak stanu zapalnego	Liza Stan zapalny komórek sąsiednich

Przyczyny apoptozy:

Tutaj wypunktowałam, bo to stanowiło całość:

• Apoptoza niezbędna do prawidłowego rozwoju:

• resorpcja ogona kijanki podczas metamorfozy

• zanik tkanki pomiędzy palcami u płodu

• eliminowanie „nadmiaru” komórek podczas tworzenia się synaps w trakcie rozwoju mózgu.

• W dojrzałych tkankach stale odtwarzane są np. komórki krwi, nabłonkowe.

Codziennie u dorosłego człowieka ginie ok. 90 mld komórek na drodze apoptozy.

• Niszczenie komórek, które zagrażają integralności organizmu:

• Niszczenie komórek zainfekowanych przez wirusy przez cytotoksyczne limfocyty T (CTLs)

Jakie czynniki decydują o rozpoczęciu apoptozy?

• Zanik pozytywnych sygnałów

• Brak dostatecznej ilości czynników wzrostu dla neuronów, interleukiny-2 (ILOR?) dla mitozy limfocytów

• Otrzymywanie negatywnych sygnałów ze środowiska zewnętrznego (wzrost stężenia ROS, UV) lub wewnętrznego (kumulacja białek o nieprawidłowej III rzędowej strukturze)

Główne czynniki regulujące apoptozę - p53, rodzina białek Bcl-2, cytochrom c, TNF (Tumor Necrosis Factor), ligand Fas & receptor, kaspazy (proteazy cyseinowe, odpowiadające za proteolizę białek podlegających apoptozie), endonukleazy (grupa nukleaz, odpowiedzialna za odpowiednie cięcie DNA podczas apoprozy).

Ligand Fas oraz TNF-α oddziaływują na kaspazy poczatkowe (6,8,9,12), które rozpoczynają kaskadę kaspaz, działając na kaspazy wykonawcze 2, 3 (najważniejsza), 7

Indukcja apoptozy:

1. szlak zewnętrzny, receptorowy:

1. Fas + FasL→ DISC→ aktywacja kaspazy 8 → kaskada kaspaz, m. in. kaspaza 3 (najważniejsza)

Następuje rozpoznanie białka błony Fas przez ligand FasL Odwrotnie!!!Fas, białko integralne błony, rozpoznaje swój ligand FasL i w wyniku ich połaczenia tworzy się DISC (Death I... Stimulating Comlex), który uruchamia kaspazę 8, będąca początkiem kaskady kaspaz.

2. TNF + TNFR1/2→ DISC→ aktywacja kaspazy 8 → kaskada kaspaz

TNF (ligand) łączy się z białkiem receptorowym w błonie TNFR1/2 (Tumor Necrosis Factor) i tworzy się kompleks DISC, który ma na swojej powierzchni tzw. domenę śmierci (death domain), która rozpoznaje kaspazę 8.

2. szlak wewnetrzny, mitochondrialny

Bcl 2 →Apaf1→ BAK i BAX →cytochrom c →prokaspaza 9→ apoptosom (cytochrom c+ Apaf 1+prokaspaza 9)→ kaspaza 9 →kaskada kaspaz

Do rodziny Bcl-2 należą czynniki pro- i antyapoptotyczne. Bcl-2 biorący udział w szlaku mitochondrialnym jest czynnikiem antyapoptotycznym.

Białko Bcl-2 występuje na powierzchni błony mitochondrialnej. Normalnie jest związane z Apaf-1 (A... Protease Activating Factor). Pod wpływem czynnika indukcyjnego na powierzchni błony mitochondrialnej uruchamia (uwalnia) ono Apaf-1 (typ proteazy). Apaf-1 natomiast oddziałuje z BAK i BAX (czynniki proapoptotyczne), które penetrują z cytoplazmy do mitochondriów i powodują zmianę potencjału transbłonowego mitochondriów i przez to uwolnienie transbłonowego cytochromu c z mitochondriów do cytoplazmy. Białko cytochrom c indukuje prokaspazę 9. Apaf-1 (2 cząsteczki), cytochrom c i kaspaza 9 tworzą razem tzw. apoptosom. Ma on strukturę siedmiokrotną.

Podczas apoptozy zachodzi internukleosomowa fragmentacja DNA

• Nić DNA jest cięta przez endonukleazy na poziomie nukleosomów (pomiędzy nimi).

• Aktywowana przez enzym CAD (Caspase Activated DNAse)

• Jest to bardzo ważna różnica miedzy apoptozą a nekrozą. Można je odróżnić stosując:

Dzięki elektroforezie w żelu można odróżnić apoptozę od nekrozy. Jest to tzw. metoda kometkowa, ponieważ komórka będąca w trakcie apoptozy przypomina kształtem kometę, gdzie w głowie komety znajduje się niepocięty jeszcze DNA.

1. klasyczna elektroforeza na żelu → powstaje tzw. drabinka (jadnakowe odcinki DNA)

2. metoda kometkowa (Comet Assay) - elektroforeza pojedynczych komórek na szkiełkach → w zależności od tego, czy komórka podlega apoptozie, czy nie, otrzymujemy różne obrazy:

1. DNA w obrębie jądra - nie apoptoza!

2. komety - apoptoza ← pocięte fragmenty DNA przemieszczaja się w kierunku anody (+)

3. smuga - nekroza

Czynniki indukujące apoptozę: wewnetrzne i zewnetrzne, środowiskowe.

Białka proapoptyczne - indukują apoptozę, np. w szlaku mitochondrialnym BAK lub BAX

Białka antyapoptyczne - np. białko Bcl-2 (ale nie cała rodzina!!!)

PCD u roślin

Nie możemy nazywać programowanej śmierci komórki u roślin apoptozą, ponieważ komórka roślinna nie zawsze pozostaje pod kontrolą tych samych genów apoptotycznych, co komórka zwierzęca.

PCD komórki i tkanki warunkiem rozwoju roślin wyższych:

1. w fazie embrionalnej np. zanik suspensora (wieszadełka), zanikanie 3 z 4 megaspor (makrospor)

2. w organach wegetatywncyh np. różnicowanie się elementów trychalnych (członów naczyń, z pramiazgi / miazgi) (w naczyniach w wyniku PCD zanikają połączenia pomiędzy poszczególnymi komórkami naczyń, w związku z czym transport wody dokonuje się szybciej), obumieranie liści

3. w organach generatywnych np. zanik tkanki tapetum (przylegajacej do ziarna pyłku), degradacja komórek w woreczku zalążkowym podczas mejozy

Zachodzi zatem w następujących tkankach:

• elementy trychalne i sklerenchymatyczne

• tapetum

• mezofil

• bielmo

Te przykłady omówiliśmy dokładniej.

Co PCD roślin ma wspólnego z apoptozą zwierząt? (z przykładów)

• internukleosomalna fragmentacja DNA (udowodnione dzięki metodzie kometkowej, a także reakcji TUNEL Terminal deoxunucleotidyl transferase nucoliated ??? dUTP nick end in situ labeling method)

• kondensacja chromatyny jądra i jej przemieszczenie do otoczki jądrowej w komórkach tapetum (rozpoczyna się przed zmianami w strukturze i funkcjach pozostałych organelli i przedziałów komórkowych)

• kondensacja chromatyny w komórkach mezofilu (specyficzna fragmentacja DNA poprzedza kondensację chromatyny), zmiany strukturalne chloroplastów i fragmentacja chlDNA

Jakie są rożnice?

• różnicowanie elementów trachearnych członów naczyń z komórek pramiazgi i miazgi przebiega inaczej - wcale nie!!!

• potencjał transbłonowy mitochondriów taki sam w komórkach starych i młodych - jest zmienny, ale nie zależy od wieku, tzn. zarówno wśród młodych, jak i starych występują takie, które mają wysoki ii takie, które maja niski potencjał

• BRAK KASPAZ U ROŚLIN!!! - występują białka homologiczne, tzw. białka kaspazopodobne

• indukcja PCD zachodzi przez wzrost poziomu ROS czyli tzw. aktywnych form tlenu: O2, H2O2, NO oraz przez różne czynniki zewnętrzne.

Na końcu mam jeszcze ładny schemat :)

---