Sprawozdanie 1.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 3
Data zajęć: 2008/10/17

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 1.

Zapoznanie się z metodą określania aktywności

aldolazowej wykorzystującej test hydrozynowy.

Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Marta Kłoczaniuk
Aleksandra Korkuś

Wstęp

Aldolazy to enzymy należące do klasy liaz. Występują w różnych izoformach. Izolowane

są z tkanki mięśniowej, wątroby i mózgu. Biorą udział w jeden z reakcji glikolizy oraz

glikoneogenezy. Katalizują reakcję rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 1.)

CH

2

OPO

3

C

C

C

C

CH

2

OPO

3

O

H

O

H

OH

H

OH

CH

2

OPO

3

C

C

H

O

OH

H

C

C

CH

2

OPO

3

OH

O

H

H

fruktozo-1,6-disfosforan

aldolaza

+

fosfodihydroksyaceton

aldehyd

3-fosfoglicerynowy

2-

2-

2-

2-

Reakcja 1. – Reakcja katalizowana przez aldolazę

Stężenia enzymu
można próbować wyznaczyć poprzez pomiar absorbancji  przy 280 nm
oraz stosując prawo Lamberta-Beera (1), gdzie  to współczynnik ekstynkcji, a  do długość

drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń.

   ·  ·

(1)

Aktywność enzymu wyznacza się poprzez zmianę stężenia (poprzez zmianę absorbancji)

w czasie – szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności U definiuje się zgodnie ze wzorem (2).

U 

 µmol substratu

 min

(2)

Test hydrozynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym

oznaczaniu zmiany stężenia hydrazonu aldehydu 3-fosfoglicerynowego (H) przy 240 nm.

W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny

w stosunku 1:1.

Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (3).



















(3)

Cel

Wyznaczenie stężenia aldolazy z mięśni oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym.

Wykonanie {Trzeba dopisać treść instrukcji, sam załącznik to za mało}

Doświadczenie przeprowadzono zasadniczo zgodnie z treścią instrukcji. Do wyznaczenia

stężenia aldolazy użyto po 3000 μl buforu oraz odmierzono 60 μl stężonego roztworu aldolazy.

Sprawozdanie 1.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 3
Data zajęć: 2008/10/17

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 1.

Zapoznanie się z metodą określania aktywności

aldolazowej wykorzystującej test hydrozynowy.

Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Marta Kłoczaniuk
Aleksandra Korkuś

Wyniki

Tabela 1. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych

pomiar 1°

pomiar 2°

średnia*

uwagi





µl!

60

-



"#

0,1954

odczyt
ze spektrofotometru

$

ald



mg/ml!

0,2147

$

ald





(

)*+

,

)*+

+,%

·/



0

µl!

23



0



1

ald

2

ald

)



3#

4

0,09

0,08

0,085

odczyt z wykresu 1.



3#

5

0,265

0,26

0,262

odczyt z wykresu 1.

Δ

3#

0,175

0,18

0,178

Δ

3#

 

3#

5

7 

3#

4

$

ald

0

mg/ml!

2,866 ∙ 10

–3

$

ald

0



2

ald

)

8

)9

Δt

min!

3

3

3

-

Akt

ald

0

U/ml!

0,0214

0,0220

0,0217

Akt

ald

0



<(

)=+

>

?

·/·∆A

· 10

0

Akt

tot

0

U!

0,0369

0,0379

0,0374

Akt

tot

0

 Akt

ald

0

· 

0

Akt

spec

0

U/mg!

7,47

7,68

7,58

Akt

spec

0



Akt

ald

9

2

ald

9

* średnia arytmetyczna z pomiarów 1° i 2°.

gdzie:

masa aldolazy: G

ald

 5 µg

długość drogi optycznej (szerokość kuwety):   1 cm

masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm): 

"#

#,%

 0,91

ml

mg·cm

molowy współczynnik ekstynkcji dla hydronazonu GAP (przy 240 nm): J

K

 2730

1

M·cm

objętość: 

0

 1,5 ml P 200 µl P 23 µl  1723 µl  1,723 ml

rozcieńczenie: 

0



Q

9



)9



)9





9



)9



R0 µl

0 µl

 74,9

Sprawozdanie 1.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 3
Data zajęć: 2008/10/17

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 1.

Zapoznanie się z metodą określania aktywności

aldolazowej wykorzystującej test hydrozynowy.

Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Marta Kłoczaniuk
Aleksandra Korkuś

Tabela 2. – Obliczenia dla wyjściowego roztworu aldolazy

wykonane na podstawie wartości średnich pomiarów 1° i 2°

uwagi

$

ald



mg/ml!

10,9

$

ald



 



· 

0

· $

ald

0

 



· $

ald



Akt

ald



U/ml!

82,9

Akt

ald



 



· 

0

· Akt

ald

0

Akt

tot



*

U!

82,9

Akt

tot



 Akt

ald



· 



Akt

spec



U/mg!

7,58

Akt

spec





Akt

ald



2

ald





8

)

·8

)9

·Akt

ald

9

8

)

·8

)9

·2

ald

9

 Akt

spec

0

* objętość wyjściowego preparatu aldolazy 



 1 ml.

gdzie:

rozcieńczenie: 





Q

)



)



)



0### µlT# µl

T# µl

 51

Wnioski

Dobrano odpowiednie rozcieńczenia roztworu aldolazy do badania jej aktywności metodami

spektrofotometrycznymi. Zgodnie z wykresem 1. absorbancja, więc także stężenie (1), H rośnie,

z dobrym przybliżeniem, liniowo w czasie. Aktywność aldolazowa zależy od stężenia enzymu,

im roztwór bardziej rozcieńczony tym aktywność aldolazowa mniejsza. Aktywność całkowita

(totalna) zależy od objętości roztworu. Aktywność specyficzna aldolazy nie zależy od stężenia

enzymu i wynosi średnio 7,58 U/mg. Średnią arytmetyczną wyznaczono z dwóch niezależnych

od siebie pomiarów dających zbliżone wyniki (ich odchylenie standardowe wynosi 0,15).

{Można było dodać coś o samym teście enzymatycznym.}

Załączniki

1.

Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch pomiarów (Wykres 1.).

2.

Instrukcja „Ćwiczenie 1.” wraz z bieżącymi notatkami.