Sprawozdanie 2.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 4
Data zajęć: 2008/10/24

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 2.

Sporządzenie nasyconego roztworu

siarczanu amonu.

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Ćwiczenie 2. Wstęp

Siarczan amonu

NH







SO



to bezbarwne ciało stałe; substancja krystaliczna i higroskopijna.

Masa molowa 132,14

[1]

g/mol; gęstość 1,77

[1]

g/cm

3

(20°C), rozpuszczalność w wodzie 760

[1]

g/l (20°C),

pH 5-6

[1]

(50 g/l H

2

O, 20°C). Rozpuszczalność znacznie zależy od temperatury. Sól hydrolizuje,

zgodnie z reakcją 1., a przez to pH jest lekko kwaśne (sól mocnego kwasu i słabej zasady).

NH



2H



O  NH



OH H

O

(Reakcja 1.)

Rozpuszczalność białek zależy w szczególności od: temperatury, pH, siły jonowej roztworu oraz zdolności

białka do hydratacji. Wysalanie białek jest procesem wytrącania białka z roztworu. Polega na uszkodzeniu

otoczki hydratacyjnej, białko staje się mniej rozpuszczalne. Rozpuszczalność większości białek zmniejsza

się w roztworach stężonych soli (zmiana siły jonowej roztworu). Często stosowaną solą do wysalania

białek jest siarczan amonu. Białko najłatwiej wysolić w pH równym jego punktowi izoelektrycznemu

(wówczas rozpuszczalność białka jest najmniejsza). Jest to proces odwracalny. Rozpuszczalności różnych

białek są różne. Wysalanie stosuje się do frakcjonowania białek, wstępnego oczyszczania, a w szczególności

do zagęszczania rozcieńczonych roztworów białek. Sól można usunąć z roztworu stosując dializę.

[1] Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej CHEMPUR – siarczan amonu (http://alchem.eu/_upload/pliki/amonu_siarczan.pdf).

Ćwiczenie 2. Cel

Przygotowanie 100 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu potrzebnego do Ćwiczenia 3.

Ćwiczenie 2. Wykonanie

Przygotowano zlewkę 300 ml. Podgrzewając i mieszając rozpuszczono 90 g siarczanu amonu

w 100 ml 1 mM EDTA. Pod wyciągiem miareczkowano roztwór 5% roztworem amoniaku do pH 7,5.

Ciepły roztwór przesączono przez lejek Büchnera, użyto pompki wodnej. Przesączony roztwór

przelano do zlewki 300 ml. Zlewkę podpisano i przykryto folią aluminiową.

Ćwiczenie 2. Wyniki

Używając wagi analitycznej odważono 90 g siarczanu amonu.



NH







SO



 90 g



zlewki

 130,6 g



ważona

 

NH







SO





zlewki

 220,6 g

Używając cylindra miarowego zmierzono 100 ml 1 mM EDTA. Używając uniwersalnych papierków

wskaźnikowych określano pH roztworu (żółty pH 6,0; zielony pH 7,0; ciemnozielony pH 7,5).

Ćwiczenie 2. Wnioski

Otrzymano ok. 100 ml nasyconego roztwór siarczanu amonu o pH 7,5. Podczas ogrzewania

nieznaczna ilość roztworu mogła wyparować. Intensywnie mieszano, dzięki temu rozpuszczono cały

dodany siarczan amonu. Rozpuszczalność siarczanu amonu rośnie wraz z temperaturą. Przy sączeniu

roztwór ostygał. Niewielkie ilości nadmiaru siarczanu amonu wykrystalizowały na sączku.

Sprawozdanie 2.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 4
Data zajęć: 2008/10/24

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 1.

Zapoznanie się z metodą określania aktywności

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy.

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

W ramach dodatkowego zadania powtórzono Ćwiczenie 1. z dnia 2008/10/17.

Ćwiczenie 1. Wstęp

Aldolazy to enzymy należące do klasy liaz. Występują w różnych izoformach. Izolowane

są z tkanki mięśniowej, wątroby i mózgu. Biorą udział w jeden z reakcji glikolizy oraz

glikoneogenezy. Katalizują reakcję rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 2.)

CH

2

OPO

3

C

C

C

C

CH

2

OPO

3

O

H

O

H

OH

H

OH

CH

2

OPO

3

C

C

H

O

OH

H

C

C

CH

2

OPO

3

OH

O

H

H

fruktozo-1,6-disfosforan

aldolaza

+

fosfodihydroksyaceton

aldehyd

3-fosfoglicerynowy

2-

2-

2-

2-

Reakcja 2. – Reakcja katalizowana przez aldolazę

Stężenia enzymu # można próbować wyznaczyć poprzez pomiar absorbancji $ przy 280 nm
oraz stosując prawo Lamberta-Beera (1), gdzie % to współczynnik ekstynkcji, a & to długość
drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń.

$  % · & · #

(1)

Aktywność enzymu wyznacza się poprzez zmianę stężenia (poprzez zmianę absorbancji)

w czasie – szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności U definiuje się zgodnie ze wzorem (2).

U 

) µmol substratu

) min

(2)

Test hydrazynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym

oznaczaniu zmiany stężenia hydrazonu aldehydu 3-fosfoglicerynowego (H) przy 240 nm.

W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny

w stosunku 1:1.

Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (3).

1

2



3

4

3

5

3

5

(3)

Ćwiczenie 1. Cel

Wyznaczenie stężenia aldolazy z mięśni oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym.

Porównanie otrzymanych wyników z Ćwiczeniem 1. z dnia 2008/10/17.

Sprawozdanie 2.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 4
Data zajęć: 2008/10/24

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 1.

Zapoznanie się z metodą określania aktywności

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy.

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Ćwiczenie 1. Wykonanie

W części I wyznaczono stężenie aldolazy. Odmierzono 3 ml buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA).

Zmieszano z 60 μl stężonego roztworu aldolazy (o nieznanym stężeniu). Odnośnik sporządzono

używając samego buforu. Zmierzono absorbancję $

67

względem odnośnika przy 280 nm.

W części II wyznaczono aktywność aldolazy. Odmierzono 1,5 ml 2,6 mM siarczanu hydrazyny zawartym

w roztworze (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). Zmieszano z 200 μl 30 mM fruktozodifosforanu. Odnośnik

sporządzono analogicznie. Wyzerowano spektrofotometr względem odnośnika. Dodano 25 μl roztworu

aldolazy z części I, natomiast do odnośnika dodano taką samą objętość buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM

EDTA). Zmierzono absorbancję $

7

względem odnośnika przy 240 nm przez 3 minuty. Część II powtórzono.

Ćwiczenie 1. Wyniki

Tabela 1. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych

pomiar 1°

pomiar 2°

średnia*

uwagi

8

9:

;µl<

60

-

$

67

0,1842

odczyt
ze spektrofotometru

=

ald



;mg/ml<

0,2024

=

ald





@

AB

C

AB

B,)%

·E

8

:

;µl<

25

8

:



F

ald

G

ald



$

7

H

0,13

0,09

0,11

odczyt z wykresu 1.

$

7

I

0,32

0,30

0,31

odczyt z wykresu 1.

Δ$

7

0,19

0,21

0,20

Δ$

7

 $

7

I

K $

7

H

=

ald

;mg/ml<

2,933 ∙ 10

–3

=

ald



G

ald



L

:M

Δt

;min<

3

3

3

-

Akt

ald

;U/ml<

0,0232

0,0256

0,0244

Akt

ald



O@

B

P

Q

·E·∆S

· 10

Akt

tot

;U<

0,0400

0,0442

0,0421

Akt

tot

 Akt

ald

· 8

Akt

spec

;U/mg<

7,91

8,73

8,32

Akt

spec



Akt

ald

M

G

ald

M

* średnia arytmetyczna z pomiarów 1° i 2°.

gdzie: masa aldolazy: 

ald

 5 µg

długość drogi optycznej (szerokość kuwety): &  1 cm
masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm): %

67

7,9%

 0,91

ml

mg·cm

molowy współczynnik ekstynkcji dla hydranazonu GAP (przy 240 nm): W

X

 2730

1

M·cm

objętość: 8

 1,5 ml 200 µl 25 µl  1725 µl  1,725 ml

rozcieńczenie: 1

:



3[

M

3

:M

3

:M



3

M

3

:M



9\] µl

] µl

 69

Sprawozdanie 2.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 4 z 4
Data zajęć: 2008/10/24

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 1.

Zapoznanie się z metodą określania aktywności

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy.

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Tabela 2. – Obliczenia dla wyjściowego roztworu aldolazy

wykonane na podstawie wartości średnich pomiarów 1° i 2°

uwagi

=

ald

9

;mg/ml<

10,3

=

ald

9

 1

9:

· 1

:

· =

ald

 1

9:

· =

ald



Akt

ald

9

;U/ml<

85,9

Akt

ald

9

 1

9:

· 1

:

· Akt

ald

Akt

tot

9

*

;U<

85,9

Akt

tot

9

 Akt

ald

9

· 8

9

Akt

spec

9

;U/mg<

8,32

Akt

spec

9



Akt

ald

)

G

ald

)



L

):

·L

:M

·Akt

ald

M

L

):

·L

:M

·G

ald

M

 Akt

spec

* objętość wyjściowego preparatu aldolazy 8

9

 1 ml.

gdzie:

rozcieńczenie: 1

9:



3[



3

):

3

):



777 µl ^7 µl

^7 µl

 51

Ćwiczenie 1. Wnioski

Dobrano odpowiednie rozcieńczenia roztworu aldolazy do badania jej aktywności metodami

spektrofotometrycznymi. Stężenie aldolazy w roztworze wyjściowym wynosi 10,3 mg/ml.

Zgodnie z wykresem 1. absorbancja, więc także stężenie (1), H rośnie, z dobrym

przybliżeniem, liniowo w czasie. Aktywność aldolazowa zależy od stężenia enzymu,

im roztwór bardziej rozcieńczony tym aktywność aldolazowa mniejsza. Aktywność całkowita

(totalna) zależy od objętości roztworu. Aktywność specyficzna aldolazy nie zależy od stężenia

enzymu i wynosi średnio 8,32 U/mg. Średnią arytmetyczną wyznaczono z dwóch niezależnych

od siebie pomiarów dających zbliżone wyniki (ich odchylenie standardowe wynosi 0,58).

Ćwiczenie 1. wykonano mniej dokładnie niż dnia 2008/10/17 (wtedy odchylenie standardowe

wyników wynosiło 0,15). Aktywność specyficzną wyznaczono wówczas na 7,58 U/mg.

Pomiary wykonywano korzystając z tego samego spektrofotometru.

Test hydrazynowy pozwolił na wyznaczenie aktywności aldolazy. Jest to szybka i prosta

metoda. Jej zastosowanie było możliwe, ponieważ w reakcji powstawał produkt H, który

posiadał maksimum absorbancji przy 240 nm. Inne substraty reakcji w roztworze praktycznie

nie absorbowały przy 240 nm.

Załączniki

1.

Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch pomiarów (Wykres 1.).

2.

Instrukcja „Ćwiczenie 1.” wraz z bieżącymi obliczeniami.

3.

Instrukcja „Ćwiczenie 2.” wraz z bieżącymi obliczeniami.