Sprawozdanie 3.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 5
Data zajęć: 2008/11/07

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 3.

Preparacja aldolazy z mięśni królika

według metody Taylora i wsp.

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Ćwiczenie 3. Wstęp

Preparacja białek polega na izolowaniu danego białka z próbki biologicznej. Dobrze dobrana

metoda pozwala na uzyskanie „czystego” białka do dalszych badań.

Taylor i współpracownicy opracowali metodę preparacji aldolazy z mięśni królika. Jak każda

preparacja jest wieloetapowa (Rysunek 1.). Składa się zasadniczo z: dwóch wysalań (50% i 52%

wysyconym roztworem siarczanu amonu), dwóch wirowań oraz końcowej krystalizacji.

Za każdym razem osad się odrzuca. Metoda jest dość prosta i krótka, jednak mało specyficzna.

Rysunek 1. – Etapy preparacji aldolazy metodą Taylora i wsp.

Wydajność (masowa) preparacji aldolazy jest stosunkiem masy aldolazy w danym przesączu

do teoretycznej masy całkowitej izolowanej aldolazy w próbce. Najczęściej wydajność

preparacji

wyraża się w procentach. Założono, że w przesączu pierwszym masa aldolazy

jest równa masie aldolazy zawartej w mięśniach (czyli 100%), wówczas



wyraża wzór (1).







ald

przesączu 



ald

calłkowita

· 100% 

Akt

spec

przesączu 1

Akt

spec

przesączu 2

· 100%

(1)

Ćwiczenie 3. Cel

Izolacja aldolazy z mięśni królika.

Ćwiczenie 3. Wykonanie

Rozmrożono, a następnie pokrojono i zmielono rozmrożone mięśnie królika. Zhomogenizowano

w 100 ml wody dejonizowanej w zlewce. Ekstrahowano białka mieszając bagietką przez

10 min w łaźni lodowej.

Przelano mieszaninę do probówek wirowych, zrównoważono, odwirowano (13 000 obr./min,

15 min, 2-4°C). Supernatant przelano do czystej, schłodzonej zlewki przez lejek z watą

szklaną. Pobrano 0,5 ml mieszaniny do oznaczenia aktywności aldolazy w przesączu 1.

Postępowano zgodnie z Ćwiczeniem 1. Zanotowano objętość pozostałej mieszaniny.

Pod wyciągiem miareczkowano mieszaninę 5% roztworem amoniaku do pH 7,5. Zanotowano

objętość dodanego amoniaku. Wysalano białka dodając małymi porcjami 97,5 ml nasyconego

roztworu siarczanu amonu przygotowanego w Ćwiczeniu 2. przez 5 min. Zlewkę trzymano

w łaźni lodowej, zawartość mieszano bagietką przez kolejne 15 min. Sprawdzano

pH mieszaniny.

Przelano mieszaninę do probówek wirowych, zrównoważono, odwirowano (13 000 obr./min,

25 min, 2-4°C). Supernatant przelano do czystej, schłodzonej zlewki. Pobrano 0,5 ml

mieszaniny do oznaczenia aktywności aldolazy w przesączu 2. Postępowano zgodnie

z Ćwiczeniem 1. Zanotowano objętość pozostałej mieszaniny. Wysalano białka dodając

małymi porcjami 7,9 ml nasyconego roztworu siarczanu amonu przygotowanego w Ćwiczeniu 2.

przez 10 min. Zlewkę trzymano w łaźni lodowej, zawartość mieszaną bagietką. Sprawdzano

pH mieszaniny.

Otrzymaną mieszaninę przelano do kolby stożkowej i pozostawiono w temperaturze 5°C

na tydzień do krystalizacji.

rozmrożenie

i homogenizacja

ekstrakcja

wirowanie

wysalanie (50%)

supernatantu

wirowanie

wysalanie (52%)

supernatantu

krystalizacja

i rekrystalizacje

Sprawozdanie 3.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 5
Data zajęć: 2008/11/07

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 3.

Preparacja aldolazy z mięśni królika

według metody Taylora i wsp.

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Ćwiczenie 3. Wyniki

Tabela 1. – Objętości roztworów



przesącz 1

ml"



#NH

&

'



SO

&

*

ml"



przesącz 2

ml"



#NH

&

'



SO

&



ml"

95,0*

97,5**

190,0*

7,9***

gdzie:

* zmierzona objętość

** miareczkowano do pH 7,5 dodając 25 kropli 5% roztworu amoniaku (1 kropla to ok. 100 μl)



NH

+

·H



O

 25 kropli  2,5 ml



#NH

&

'



SO

&

*

 

przesącz 1

. 

NH

+

·H



O

*** objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu, aby uzyskać 52% stopień wysycenia:

100% · 

#NH

&

'



SO

&



. 50% · 

przesącz 2

 52% · /

przesącz 2

. 

#NH

&

'



SO

&



0



#NH

&

'



SO

&





*

1



przesącz 2

Tabela 2. – Obliczenia dla roztworu aldolazy w kuwetach pomiarowych

przesącz 1

przesącz 2

uwagi



*2

µl"

100

-

4

56

0,6854

0,3197

odczyt
ze spektrofotometru

7

białek



mg/ml"

0,753

0,351

7

białek





;

<=

>

<=

=,?%

·@



2A

µl"

100

-

Akt

ald



U/ml"

0,8244

0,4392

Akt

ald



 C

2A

· Akt

ald

A

4

16

D

0,275

0,14

odczyt z wykresu 1.

4

16

E

0,65

0,34

odczyt z wykresu 1.

Δ4

16

/∆H

1/min"

0,125

0,0667

Δ4

16

 4

16

E

J 4

16

D

∆H  3 min

7

białek

A

mg/ml"

0,04183

0,0195

7

białek

A



L

białek



M

2+

Akt

ald

A

U/ml"

0,0458

0,0244

Akt

ald

A



N;

&=

/∆O

P

Q

·@

· 10

A

Akt

tot

A

U"

0,0824

0,0439

Akt

tot

A

 Akt

ald

A

· 

A

Akt

spec

A

U/mg"

1,095

1,251

Akt

spec

A



Akt

ald

+

L

białek

+

gdzie:

długość drogi optycznej (szerokość kuwety):

R  1 cm

masowy współczynnik ekstynkcji dla aldolazy mięśniowej (przy 280 nm):

S

56

6,*%

 0,91

ml

mg·cm

molowy współczynnik ekstynkcji dla hydranazonu GAP (przy 240 nm):

U

V

 2730

1

M·cm

objętość:



A

 1,5 ml . 200 µl . 100 µl  1800 µl  1,8 ml

rozcieńczenie:

C

2A



Z[

+

\Z

2+

Z

2+



Z

+

Z

2+



*566 µl

*66 µl

 18

Sprawozdanie 3.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 5
Data zajęć: 2008/11/07

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 3.

Preparacja aldolazy z mięśni królika

według metody Taylora i wsp.

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Tabela 3. – Obliczenia dla pobranych próbek przesączu

przesącz 1

przesącz 2

uwagi

7

białek

*

mg/ml"

23,3

10,9

7

białek

*

 C

*2

· C

2A

· 7

białek

A

 C

*2

· 7

białek



Akt

ald

*

U/ml"

25,6

13,6

Akt

ald

*

 C

*2

· C

2A

· Akt

ald

A

 C

*2

· Akt

ald



Akt

tot

*

U"

2,43 ∙ 10

3

2,58 ∙ 10

3

Akt

tot

*

 Akt

ald

*

· 

przesącz ]

Akt

spec

*

U/mg"

1,095

1,251

Akt

spec

*



Akt

ald

?

L

białek

?



M

?2

·M

2+

·Akt

ald

+

M

?2

·M

2+

·L

białek

+

 Akt

spec

A

^

białek

*

g"

2,21

2,07

całkowita masa białek
^

białek

*

 7

białek

*

· 

przesącz ]

%"

100

87,5

zgodnie ze wzorem (1)

gdzie:

objętość:





 3000 µl . 100 µl  3100 µl  3,1 ml

rozcieńczenie:

C

*2



Z[



\Z

?2

Z

?2



Z



Z

?2



A*66 µl

*66 µl

 31

Ćwiczenie 3. Wnioski

Wysalanie białek przeprowadzano przez powolne dodawanie nasyconego roztworu siarczanu

amonu oraz intensywne mieszanie w celu uniknięcia miejscowego przesycenia roztworu.

Stężenie białek w przesączu 2 jest mniejsze niż w przesączu 1.

Kontrolowano ważne parametry podczas preparacji takie jest temperatura i pH. Gdy wysalano

to pH mieszaniny z aldolazą utrzymywało się w przedziale 7-7,5. Nie trzeba dodawać było

amoniaku w celu alkalizacji odczynu roztworu.

Wyznaczając szybkość zmiany absorbancji na wykresie 1. dla przesączu 2. poprowadzono

styczną do wykresu pomijając początkową zmianę absorbancji, która miała charakter

nieliniowy, w celu lepszego oszacowania faktycznej szybkości zmiany absorbancji.

Aktywność specyficzna aldolazy w przesączu 1 wynosi 1,095 U/mg natomiast w przesączu 2

wynosi 1,251 U/mg. Im wyższa aktywność specyficzna tym wyizolowana aldolaza

aktywniejsza („czystsza”). W Ćwiczeniu 1. z dnia 2008/10/17 aktywność specyficzna aldolazy

z mięśni królika wynosiła 7,58 U/mg. Jest to znacząca różnica. Może wynikać ona

z jakości użytego mięsa, ale przede wszystkim z wybranej lepszej metody preparacji.

Aktywność totalna w kolejnych preparacjach powinna maleć, natomiast aktywność specyficzna

powinna rosnąc. Uzyskano wydajność preparacji wynoszącą 87,5% dla przesączu 2.

Sprawozdanie 3.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 4 z 5
Data zajęć: 2008/11/07

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 1.

Zapoznanie się z metodą określania aktywności

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy.

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Zmiany stężeń białek i aktywności aldolazy przy preparacji aldolazy w Ćwiczeniu 3. badano

spektrofotometrycznie tak jak w Ćwiczeniu 1.

Ćwiczenie 1. Wstęp

Aldolazy to enzymy należące do klasy liaz. Występują w różnych izoformach. Izolowane

są z tkanki mięśniowej, wątroby i mózgu. Biorą udział w jeden z reakcji glikolizy oraz

glikoneogenezy. Katalizują reakcję rozszczepienia oraz kondensacji aldolowej (Reakcja 1.).

CH

2

OPO

3

C

C

C

C

CH

2

OPO

3

O

H

O

H

OH

H

OH

CH

2

OPO

3

C

C

H

O

OH

H

C

C

CH

2

OPO

3

OH

O

H

H

fruktozo-1,6-disfosforan

aldolaza

+

fosfodihydroksyaceton

aldehyd

3-fosfoglicerynowy

2-

2-

2-

2-

Reakcja 1. – Reakcja katalizowana przez aldolazę

Stężenia enzymu

_ można próbować wyznaczyć poprzez pomiar absorbancji 4 przy 280 nm

oraz stosując prawo Lamberta-Beera (2), gdzie

S to współczynnik ekstynkcji, a R to długość

drogi optycznej. Zależność absorbancji od stężenia może mieć charakter liniowy dla małych stężeń.

4  S · R · _

(2)

Aktywność enzymu wyznacza się poprzez zmianę stężenia (poprzez zmianę absorbancji)

w czasie – szybkość zmiany stężenia. Jednostkę aktywności

U definiuje się zgodnie ze wzorem (3).

U 

? µmol substratu

? min

(3)

Test hydrazynowy służy do wyznaczania aktywności aldolazy. Polega na spektrofotometrycznym

oznaczaniu zmiany stężenia hydrazonu aldehydu 3-fosfoglicerynowego (H) przy 240 nm.

W reakcji charakterystycznej H powstaje z aldehydu 3-fosfoglicerynowego i siarczanu hydrazyny

w stosunku 1:1.

Stężenia i aktywności aldolazowe są proporcjonalne do rozcieńczenia (4).

C

]



Z

`

\Z

a

Z

a

(4)

Ćwiczenie 1. Cel

Wyznaczenie stężenia aldolazy oraz oznaczenie jej aktywności testem hydrazynowym.

Sprawozdanie 3.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 5 z 5
Data zajęć: 2008/11/07

Enzymologia (BTC4033l)
laboratorium
mgr inż. Dominika Bystranowska
PT, 16:10-18:45, F-4/C3

Ćwiczenie 1.

Zapoznanie się z metodą określania aktywności

aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy.

Grupa IV
Anna Dawiec
Mateusz Jędrzejewski
Aleksandra Korkuś

Ćwiczenie 1. Wykonanie

W części I wyznaczono stężenie aldolazy. Odmierzono 3 ml buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM

EDTA). Zmieszano z 100 μl roztworu aldolazy (o nieznanym stężeniu). Odnośnik sporządzono

używając samego buforu. Zmierzono absorbancję

4

56

względem odnośnika przy 280 nm.

W części II wyznaczono aktywność aldolazy. Odmierzono 1,5 ml 2,6 mM siarczanu hydrazyny

zawartym w roztworze (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). Zmieszano z 200 μl 30 mM

fruktozodifosforanu. Odnośnik sporządzono analogicznie. Wyzerowano spektrofotometr

względem odnośnika. Dodano 100 μl roztworu aldolazy z części I, natomiast do odnośnika

dodano taką samą objętość buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA). Zmierzono absorbancję

4

16

względem odnośnika przy 240 nm przez 3 minuty.

Ćwiczenie 1. Wyniki

Wyniki umieszczono w Ćwiczeniu 3. Wyniki.

Ćwiczenie 1. Wnioski

Wnioski umieszczono w Ćwiczeniu 3. Wnioski.

Załączniki

1.

Wykres spektrofotometru: zmiany absorbancji w czasie dla dwóch preparacji (Wykres 1.).

2.

Instrukcja „Ćwiczenie 1.” wraz z bieżącymi obliczeniami.

3.

Instrukcja „Ćwiczenie 3.” wraz z bieżącymi obliczeniami.