1. Lipidy

Przez dziesiątki lat postęp w chemii lipidów pozostawał daleko w tyle za badania-
mi innych głównych związków biologicznych, szczególnie węglowodanów i bia-
łek. Powodowane było to faktem, iż łatwiej było opracować metody izolacji
i badań tych związków, dzięki czemu bardzo często uzyskiwano je w stanie

jednorodnym i krystalicznym. Tłuszcze i inne związki z nimi związane są z regu-

ły bezpostaciowe i trudne do izolacji i rozdzielenia metodami stosowanymi w po-
czątkach wieku. Inną przyczyną zaniedbań w badaniach lipidów było przekonanie
o ich biologicznej bierności. Jeszcze w chwili obecnej w wielu podręcznikach
można spotkać się ze stwierdzeniem, że lipidy służą głównie jako źródło i maga-
zyn energii. W tym braku naukowego zainteresowania lipidami zdarzały się jed-
nak wyjątki, jak np. wykazanie przydatności oleju z azjatyckich drzew z rodzaju
Hydnocarpus w leczeniu trądu, czy też aktywności witaminowych i hormonal-
nych różnych lipidów izoprenoidowych. Szczególnym bodźcem dla rozwoju ba-
dań stały się kontrowersje dotyczące możliwego biologicznego efektu „utwardza-
nych" przez katalityczną hydrogenację olejów. Wyjątkowo intensywny rozwój
badań lipidów zaobserwowano w ostatnich 50 latach. Przyczyną tego rozwoju
było uświadomienie sobie istotnej biologicznej roli lipidów i to w wielu poprze-
dnio nieoczekiwanych aspektach. Rozwój technik badawczych stał się także
bodźcem dla dalszych odkryć dotyczących biologicznej i technologicznej istotno-
ści lipidów.

Pierwszą poważną próbą klasyfikacji lipidów były prace Bloora z 1920

i 1925 r., w których opisuje lipidy jako dużą klasę związków biologicznych obej-
mujących kwasy tłuszczowe i ich naturalne pochodne, a także inne chemicznie do

nich podobne związki występujące w naturze. Bloor określał dalej lipidy jako
związki, które:

- Są nierozpuszczalne w wodzie, lecz rozpuszczają się w rozpuszczalnikach

„tłuszczowych", takich jak eter etylowy, chloroform, benzen czy wrzący etanol.
Ta właściwość jest najistotniejszą cechą różniącą lipidy od innych głównych grup
związków pochodzenia biologicznego. Później okazało się jednak, że właściwość
ta nie jest absolutna, np. niektóre lipidy tworzą zawiesiny w wodzie przypomina-

jące roztwory prawdziwe. Wykazano również, że pewne lipidy mogą być nie-

rozpuszczalne w niektórych rozpuszczalnikach organicznych - np. fosfatydy-
locholiny w acetonie, fosfatydyloetanolaminy w etanolu, a sfingomieliny czy gli-
kolipidy w eterze etylowym.

- Są związane z kwasami tłuszczowymi będąc aktualnie bądź potencjalnie ich

estrami.

- Występują w żywych organizmach.
Ostatnie dwie cechy zostały wprowadzone dla wykluczenia związków organi-

cznych nie posiadających biochemicznego związku z tłuszczami i kwasami tłusz-

1. Lipidy 12

czowymi, a które z racji swojej rozpuszczalności mogłyby być klasyfikowane

jako lipidy. Klasyfikacja Bloora obejmowała trzy grupy lipidów:

- lipidy proste (estry kwasów tłuszczowych z alkoholami),
- lipidy złożone (estry kwasów tłuszczowych zawierające dodatkowe grupy

lub reszty funkcjonalne),

- pochodne lipidów (związki powstające z powyższych grup podczas hydro-

lizy).

Od czasu opracowania klasyfikacji Bloora odkryto ogromną liczbę nowych

lipidów i ich kompleksów, tak że obecnie klasyfikacja lipidów obejmuje bardzo
wiele grup związków, w tym i syntetycznych. Oparta na strukturze chemicznej
podana poniżej klasyfikacja biochemiczna lipidów została opracowana na podsta-
wie uzupełnionych klasyfikacji Katesa z 1972 r. i Burtona z 1974 r. Zgodnie z nią
lipidy dzielą się na następujące klasy:

1. Węglowodory

Klasa ta obejmuje najprostsze typy lipidów występujących jako proste, rozga-

łęzione czy też nienasycone łańcuchy o różnej długości.

1.1. Proste, nasycone węglowodory (parafiny)
1.2. Węglowodory o łańcuchu pojedynczo rozgałęzionym

Występują przeważnie w dwu rodzajach: serii iso- ο wzorze ogólnym oraz

serii anteiso-.

1.3. Węglowodory o wielorozgałęzionym łańcuchu - nasycone izoprenoidy
l .4. Proste jednonienasycone węglowodory

Przedstawiciele tej grupy o nieparzystej liczbie atomów węgla powstałe pra-

wdopodobnie przez dekarboksylację naturalnych, parzystowęglowych jedno-
nienasyconych kwasów tłuszczowych.

Np. 10- lub 8- heptadecen odpowiednio z kwasu wakcenowego i olejowego,

a 8-pentadecen z kwasu palmitoolejowego.

1.5. Jednorozgałęzione, nienasycone węglowodory. Występują jako serie iso-

i anteiso-.

1.6. Wielonienasycone izoprenoidy
1.7. Karotenoidy

Grupa ta zawiera wielonienasycone węglowodory izoprenoidowe o 40 ato-

mach węgla. Niektóre z wiązań podwójnych występują w układzie sprzężonym.
Silnie pochłaniają światło i często są jaskrawo kolorowe.

2. Alkohole

Naturalne alkohole alifatyczne występują częściej w postaci estrowej lub ete-

rowej niż w stanie wolnym. Łańcuchy ich mogą być proste, rozgałęzione, a także
nienasycone o różnej długości. Alkohole te są głównie alkoholami I i II rzędowy-
mi, a rzadziej III rzędowymi.

2.1. Proste, nasycone alkohole
Najczęściej występującymi są alkohole I rzędowe. U bakterii wykazano obe-

cność również alkoholi II rzędowych, takich jak 2-oktadekanol i 2-eikozanol.

Podział lipidów 13

2.2. Alkohole Jednorozgałęzione
Znane są dwa typy tych alkoholi: seria iso- oraz seria anteiso-.
2.3. Alkohole wielorozgałęzione - nasycone izoprenoidy
Alkohole zawierające łańcuch mieszany, np. bicyklopentanofitanol.
2.4. Alkohole nienasycone

Jednonienasycone alkohole są zwykle analogiczne do jednonienasyconych

kwasów tłuszczowych.

2.5. Alkohole izoprenoidowe (terpenole i poliprenole)
Występują powszechnie w świecie bakterii, roślin i zwierząt. Znane są rów-

nież alkohole poliizoprenoidowe, posiadające w cząsteczce jedną nasyconą jed-
nostkę izoprenoidową, jak np. baktoprenol (n=l l, C 55).

Również fitol jest częściowo nasyconym poliizoprenoidem.
2.6. Sterole
Związki te są szeroko rozprzestrzenione u organizmów eukariotycznych -

zwierząt (zoosterole), roślin (fitosterole), a także drożdży.

Inne steroidy, jak dinosterol, występują w organizmach morskich. Fukosterol,

klondrillasterol i proferasterol występują wraz z ergosterolem i cholesterolem
u pierwotniaków. W komórkach bakteryjnych wykazano obecność sterolopodob-
nych lipidów - hopanoidów.

2.7. Alkohole witaminowe
Należą tu witaminy rozpuszczalne w tłuszczach.
2.8. Długołańcuchowe poliole (polialkohole)
Są to rzadkiego typu lipidy występujące przede wszystkim w organizmach

bakteryjnych.

3. Długołańcuchowe aminoalkohole

Ta klasa lipidów obejmuje zasadniczo pochodne lub homologi sfingozyny -

C18 aminodiolu. Te długołańcuchowe zasady występują z reguły jako składniki
sfingolipidów - ceramidów, cerebrozydów, sfingozylofosfatydów (sfingomielin)
i gangliozydów.

4. Aldehydy
Długołańcuchowe aldehydy występują w formie wolnej, jak np. w wydzieli-

nach oleistych roślin czy też feromonach owadzich lub w postaci eterów winylo-

wych (alk-1-enylo eterów) w analogach glicerydów i fosfatydów (plazmaloge-
nach)

4. l. Proste, nasycone aldehydy
4.2. Nienasycone aldehydy

4.3. Aldehydy Cyklopropanowe

Są analogami cyklopropanowych kwasów tłuszczowych i występują u niektó-

rych bakterii (np. Clostridium butyricum) jako składniki plazmalogenów.

4.4. Aldehydy izoprenoidowe
Niektóre z tych związków są lotnymi składnikami roślin oraz feromonów

owadzich.

1. Lipidy 14

5. Ketony
Długołańcuchowe ketony są szeroko rozpowszechnione w naturze i występują

głównie w formie wolnej. Są wśród nich

5.1. Metyloketony

5.2. Ketony symetryczne

5.3. Ketony nienasycone, rozgałęzione i cykliczne.

Występują u bakterii, a także są feromonami.

6. Fenole i chinony nieizoprenoidowe (lipidy fenolowe)
Związki te są pochodnymi fenolu i dwuhydroksybenzenów zawierającymi

długie łańcuchy węglowodorowe. Występują w świecie roślin oraz bakterii.

7. Chinony o izoprenoidowym łańcuchu bocznym

8. Kwasy tłuszczowe
Długołańcuchowe kwasy karboksylowe występują w wielu odmianach różnią-

cych się stopniem rozgałęzienia, liczbą wiązań podwójnych, obecnością innych

grup funkcjonalnych oraz długością łańcuchów. Zwykle występują w formie ze-

stryfikowanej, np. jako woski, glicerydy, fosfatydy itp.

8.1. Proste, nasycone kwasy tłuszczowe

Powszechnie występują u roślin, zwierząt i bakterii.

8.2. Jednorozgałęzione, nasycone kwasy tłuszczowe

Występują w formach iso- oraz anteiso-.

8.3. Wielorozgałęzione kwasy tłuszczowe; nasycone izoprenoidy

Wykazano w Mykobakteriach.

8.4. Cyklopropanowe i cyklopropenowe kwasy tłuszczowe

Wydzielono z bakterii i roślin.

8.5. Cyklopentenowe kwasy tłuszczowe

Wykazano w materiałach roślinnych.

8.6. Proste, jednonienasycone kwasy tłuszczowe

Powszechnie występujące w materiałach biologicznych. W większości przy-

padków występują jako izomery cis.

8.7. Wielonienasycone kwasy tłuszczowe

Powszechnie występujące w materiałach roślinnych i zwierzęcych, zasadni-

czo brak ich u bakterii.

8.8. Acetylenowe kwasy tłuszczowe

Wykazane w materiałach roślinnych.

8.9. Hydroksykwasy tłuszczowe

Występują jako różne izomery. α-Hydroksykwasy są składnikami cerebrozy-

dów. β-Hydroksykwasy są składnikami lipopolisacharydów ścian komórkowych

bakterii Gram-ujemnych, a także komórek drożdżowych; są też intermediatami

w β-oksydacji kwasów tłuszczowych. ω-Hydroksykwasy są intermediatami w ω-
oksydacji

kwasów tłuszczowych prowadzonej przez bakterie. Złożone, rozgałę-

Podział lipidów 15

zionę hydroksy kwasy tłuszczowe występują u takich bakterii, jak Mycobacteria,

Nocardia i Corynebacteria.

8.10. Ketokwasy tłuszczowe

8.11. Dwukarboksylowe kwasy tłuszczowe

8.12. Prostaglandyny

Ta grupa związków obejmuje nienasycone hydroksy lub keto-hydroksy po-

chodne C 20 kwasu cyklopentanowego. Powstają w trakcie tzw. cyklooksygena-

cji czteronienasyconego C 20 kwasu tłuszczowego - kwasu arachidonowego.

Występują przede wszystkim w świecie zwierzęcym jako tzw. informatory wtór-

ne drugiego rzędu.

9. Woski

Są estrami kwasów tłuszczowych oraz alkoholi tłuszczowych. Występują na

powierzchni skóry zwierząt, w skórce liści roślin, a także u takich bakterii, jak

Mycobacteria i Corynebacteria.

9.l. Woski proste

9.2. Woski złożone

10. Estry steroli i alkoholi witaminowych

Sterole i witaminy rozpuszczalne w tłuszczach z alkoholową grupą funkcyjną

występują powszechnie jako estry z kwasami tłuszczowymi, często podobnymi

do tych, jakie występują w glicerydach.

10.1. Estry steroli

10.2. Estry witamin

11. Estry fenoli i kwasów tłuszczowych

Wykazana ostatnio grupa związków pochodzenia roślinnego i bakteryjnego.

12. Glicerydy

Szeroko rozprzestrzeniona grupa związków nazywana również tłuszczami

obojętnymi. Są estrami glicerolu i występują jako:

12.1. Monoglicerydy

Monoestry glicerolu

12.2. Dwuglicerydy

Diestry glicerolu

12.3. Trójglicerydy

Triestry glicerolu. Naturalne zawierają co najmniej dwa różne kwasy tłuszczowe.

13. Etery glicerolowe

Łańcuchy węglowodorowe przyłączone są do rdzenia glicerolu wiązaniami

eterowymi.

13.1. Alkiloetery glicerolu

Podobnie jak u glicerydów występują w tej grupie mono-, dwu- i trój-alkiloetery.

13.2. Alk-1-enylo etery glicerolu

1. Lipidy 16

13.3. Acylowane alkiloetery glicerolu
13.4. Acylowane alk-1-enylo etery glicerolu (plazmalogeny obojętne)

14. Fosfolipidy (fosfatydy)

Główne składniki błon biologicznych organizmów żywych.

14.1. Glicerofosfatydy

Są to pochodne 1,2-dwuacylo-sn-glicerofosforanu (kwasu fosfatydowego).

Jest on połączony z resztami aminoalkoholowymi lub wielowodorotlenowymi.

Resztami aminoalkoholowymi są reszty seryny, etanolaminy i choliny, a resztami

wielowodorotlenowymi reszty glicerolu oraz ufosforylowane inozytole.

14.2. Sfingofosfatydy

Zawierają one zamiast glicerolu sfingozynę, aminoalkohol.

15. Glikolipidy

Są długołańcuchowymi pochodnymi cukrów oraz istotnymi składnikami pew-

nych błon biologicznych.

15.1 Glikozylodwuglicerydy

Składają się z mono-, dwu- lub trójsacharydów przyłączonych glikozydowo

do grup hydroksylowych dwuglicerydu. Występują głównie w materiałach roślin-

nych i bakteryjnych.

15.2. Glikozydy hydroksykwasów tłuszczowych

15.3. Estry kwasów tłuszczowych i cukrów

15.4. Pochodne fosfatydowo-cukrowe

15.5. Fitoglikolipidy

15.6. Lipopolisacharydy

Wysokocząsteczkowe kompleksy polisacharydowo-lipidowe ścian bakterii

Gram-ujemnych.

15.7. Glikozydy sterolowe

15.8. Cerebrozydy (heksozydy ceramidowe)

Są glikozydami długołańcuchowych N-acylowych zasad. Występują w mate-

riałach zwierzęcych i roślinnych.

15.9. Gangliozydy

Złożone cerebrozydy, w których reszta ceramidowa przyłączona jest do reszty

cukrowej zawierającej galaktozaminę i kwas sialowy.

16. Lipidy zawierające siarkę

Grupy hydroksylowe tych lipidów są estryfikowane resztą siarczanową.

16.1. Siarczany długołańcuchowych alkoholi
16.2. Siarczany cerebrozydów
16.3. Siarczany glikolipidów

16.4. Sulfoglikozylodwugliceryd

Istotne składniki chloroplastów roślinnych.

17. Lipidy zawierające aminokwasy

Jest to grupa lipidów obejmująca niefosfolipidowe pochodne.

1. 1. Ekstrakcja lipidów z materiałów biologicznych 17

17.1. N-acylo aminokwasy i pochodne estrowe

17.2. O-acylokarnityny

17.3. Peptydolipidy

1.1. Ekstrakcja lipidów

z materiałów biologicznych

Postępowanie ekstrakcyjne powinno umożliwić ilościowe wymycie lipidów i nie

powinno powodować ich degradacji. Efektywność postępowania zależy w dużym

stopniu od właściwości chemicznych samych lipidów oraz od rodzaju i siły ich

wiązań z innymi składnikami komórki. Głównymi oddziaływaniami są:

1. oddziaływania hydrofobowe oraz Van der Waalsa, którymi lipidy niepolar-

ne, jak np. estry steroli, glicerydy czy węglowodory wiążą się poprzez swe

łańcuchy węglowodorowe z innymi lipidami lub hydrofobowymi regionami czą-

steczek białkowych,

2. wiązania wodorowe i elektrostatyczne, w których uczestniczą lipidy polar-

ne i którymi wiążą się z białkami i lipoproteidami,

3. wiązania kowalencyjne, którymi np. kwasy tłuszczowe związane są estro-

wo, amidowo lub glikozydowo do struktur białkowych lub polisacharydowych.

Wiązania hydrofobowe łatwo zerwać stosując do ekstrakcji rozpuszczalniki

niepolarne, takie jak eter etylowy, chloroform czy benzen. Lipidy polarne, wystę-

pujące głównie w komórkowych strukturach błonowych wymagają do ekstrakcji

rozpuszczalników polarnych, takich jak etanol lub metanol w celu zerwania wią-

zań wodorowych. Lipidy związane kowalencyjnie mogą być ekstrahowane dopie-

ro po hydrolizie tych wiązań, np. w reakcji zmydlania.

Najczęściej używanymi rozpuszczalnikami do ekstrakcji lipidów są mieszani-

ny chloroformu z metanolem. W niektórych jednak przypadkach wymagane jest

dodanie jeszcze jednego, bardziej polarnego składnika (np. wodorotlenku amono-

wego). Uzyskane ekstrakty często przemywa się w celu usunięcia ewentualnie

wymytych podczas ekstrakcji takich składników komórkowych, jak cukry, ami-

nokwasy czy sole.

Uzyskane ekstrakty filtruje się, a następnie zagęszcza w atmosferze obojętnej

(azot, argon) i przechowuje się w postaci stężonych roztworów chloroformowych

(chloroform nasycony gazem obojętnym) w niskiej temperaturze (-20

0

C do

-70

0

C).

1. Lipidy 18

1.1.1. Ekstrakcja lipidów z materiału zwierzęcego

(wg Bligh E. G., Dyer W. J., Can. J. Biochem. Phys., 37 (1959) 911-918)

Materiał, odczynniki i roztwory:

zawiesina komórek lub organelli;
chloroform (2 x destylowany);
metanol o małej zawartości wody l x destylowany;

10 mM bufor Tris-HCl pH 7.4 lub 0.145 M NaCl.

Sprzęt:
rozdzielacz szklany;
wyparka próżniowa;
wirówka typu K23.

Postępowanie:
• Do l obj. zawiesiny komórek lub organelli dodać 2 obj. metanolu i wymieszać

przez kilkunastokrotne obrócenie rozdzielacza.

• Dodać l obj. chloroformu i mieszanie faz powtórzyć przez około 5 min.
• Dodać l obj. buforu lub roztworu NaCl oraz l obj. chloroformu,
• Ponownie wymieszać fazy, a następnie rozdzielacz odstawić dla ich rozdziele-

nia. Dla przyśpieszenia rozdzielenia faz można zastosować wirowanie (w pro-

bówkach szklanych !) przez 10 min przy 3000 obr. /min.

• Zebrać dolną, chloroformową fazę, do pozostałości w rozdzielaczu dodać

l obj. (w stosunku do ilości metanolu użytej na początku) chloroformu i po-

nownie mieszać fazy przez 5 min. Po rozdzieleniu zebrać fazę chloroformową.

Postępowanie powtórzyć jeszcze raz.

Uwaga: Silne wytrząsanie nie polepsza ekstrakcji, a powoduje trudności w roz-
dzielaniu faz.

• Uzyskane trzy ekstrakty chloroformowe połączyć, zmierzyć ich objętość

i przemyć je mieszając z równą objętością roztworu wodnego.

• Przemyty ekstrakt chloroformowy odparować na wyparce próżniowej.
• Uzyskane lipidy rozpuścić w określonej objętości chloroformu i przechowy-

wać w -70°C.

1.1.2. Ekstrakcja lipidów rozpuszczalnikami

o małej toksyczności

(wg Radin N. S., w: Methods in Enzymology, Vol. 72 (1981) 5-7)

Opisane postępowanie, jak i inne klasyczne metody ekstrakcji lipidów z tkanek
używają niezmiennie dwóch typów rozpuszczalników, które są zarówno toksycz-

ne w postaci par, jak i silnie drażniące w postaci cieczy. Co więcej, podczas
przechowywania chloroformu powstaje w nim fosgen i HCl. W klasycznych me-

1. 1. Ekstrakcja lipidów z materiałów biologicznych 19

todach ulegają również ekstrakcji związki nielipidowe, w tym również część

białek.

Stwierdzono, że mieszanina heksanu z izopropanolem jest tak samo dobrym

rozpuszczalnikiem dla ekstrakcji lipidów jak klasyczne mieszaniny chloroform-
metanol, a przewyższa je pod względem niskiej toksyczności. Mieszanina heksa-

nu z izopropanolem ma również mniejszą prężność par od mieszanin chloroformu
z metanolem, co zmniejsza ryzyko zagrożenia pożarowego. Mieszanina ta nie
ekstrahuje białek, ekstrahuje o wiele mniej materiału nielipidowego, w tym niepo-

żądanych barwników, ma mniejszą gęstość, a także nie absorbuje w ultrafiolecie.
Co więcej, białka pozostające po ekstrakcji są w większości nie zdenaturowane
i można je łatwo odzyskać.

Materiały, odczynniki i roztwory:
materiał biologiczny;
izopropanol, redestylowany;

heksan, redestylowany;
oraz cykloheksan i roztwór 10 g bezwodnego Na

2

SO

4

w 150 ml wody - gdy

przemywanie ekstraktu jest konieczne.

Postępowanie:

• Przygotować mieszaninę ekstrakcyjną: heksan : izopropanol 3:2 (v/v).
• Ekstrahowany materiał (upakowane komórki, tkanki) homogenizować przez

30-60 sek. w mikserze z mieszaniną ekstrakcyjną w stosunku 18 ml/g mate-
riału.

• Jednorodną zawiesinę przesączyć przez sączek ze spieku szklanego.

• Pozostałość na sączku zawiesić w 3 ml mieszaniny i pozostawić na kilka mi-

nut przed jej przesączeniem, powtórzyć to przemywanie jeszcze raz.

• Przy ekstrakcji lipidów z surowicy lub pełnej kiwi należy stosować większe

ilości mieszaniny ekstrakcyjnej - 33 ml/ml surowicy oraz zastosować stopnio-
we dodawanie materiału do miksowanej mieszaniny ekstrakcyjnej.

• Ilość zawartego w ekstrakcie heksan-izopropanol materiału nielipidowego jest

tak mała, że nie przeszkadza w analizach chromatograficznych. O ile jest to
konieczne, można zastosować jego przemywanie poprzez wymieszanie z 0.5

obj. roztworu siarczanu sodowego i odstawienie do rozdzielenia faz. Faza

górna zawiera ekstrakt lipidowy w zredukowanej objętości. Proces przemywa-

nia jest korzystny również z tego powodu, że usuwa z mieszaniny składnik
o wyższej temperaturze wrzenia, a zatem ułatwia proces odparowywania
rozpuszczalników z ekstraktu.

• Ekstrakt lipidowy odparować w wyparce próżniowej stosując nieco wyższą

temperaturę (40-45°C) oraz dodawanie dla ułatwienia odparowywania cyklo-
heksanu.

1. Lipidy 20

1.1.3. Ekstrakcja lipidów z erytrocytów

(wg Rodriguez-Vico F., Martinez-Cayuela M., Zafra M. F., Garcia-Peregrin E., Ramirez H.,
Lipids 26(l991)77-80)

Przykładowym zastosowaniem ekstrakcji lipidów rozpuszczalnikami o małej

toksyczności jest podana poniżej procedura ekstrakcji lipidów z erytrocytów,
umożliwiająca równocześnie oznaczanie białek w pozostałości poekstrakcyjnej.

Materiały i odczynniki:
zawiesina krwinek przemytych buforem PBS

1

;

heksan;
izopropanol;
chloroform;
metanol.

Sprzęt:
probówki wirówkowe;
wirówka typu K23;
wyparka próżniowa.

Postępowanie:
• 250 μl upakowanych krwinek umieścić w naczyniu (duża probówka, zlewka)

i zmieszać przy ciągłym wytrząsaniu z 25 ml mieszaniny heksanu z izopropa-
nolem (3:2).

• Odwirować całość przy 4000 x g przez 15 min.
• Supernatant przenieść ilościowo za pomocą pipetki pasterowskiej do suchej (!)

kolbki do wyparki próżniowej.

• Odparować rozpuszczalniki w wyparce (temp. maks. do 40°C).
• Suchą pozostałość lipidową rozpuścić w 200 μl mieszaniny chloroform-meta-

nol (2:1) i

przechowywać w -70°C.

1.1.4. Ekstrakcja lipidów z materiału roślinnego

Materiały, odczynniki i roztwory:
materiał roślinny (liście lub wydzielone chloroplasty);
chloroform;
metanol;

l% roztwór NaCl;

izopropanol.

Sprzęt:

rozdzielacz;

1

0.15 M NaCl zawierający 5mM bufor fosforanowy