Immunologia

– prelekcja 19.11.2007

Antygeny zgodności tkankowej – antygeny transplantacyjne

Zaliczamy do nich:



Antygeny głównego układu zgodności tkankowej (ang. Major Histocompatibility Complex, MHC) czyli produkty genów
MHC u człowieka nazywane są HLA (ang. Human Leukocyte Antigen) - są najważniejszymi antygenami zgodności
tkankowej.



Układ KIR (ang. kiler immunoglobulin-like receptor – receptor immunoglobulinopodobny biorący udział w reakcji
cytotoksycznej)



Antygeny grupowe AB0 krwinek czerwonych również działają jako silne antygeny transplantacyjne



„Słabe” antygeny zgodności tkankowej (ang. minor Histopatocompatibility Complex – mHC) lub nie kodowane przez
MHC (np. kodowane na chromosomie Y)

Antygeny MHC/HLA

Występują na niemal wszystkich jądrzastych komórkach ustroju. U ludzi MHC znajduje się na krótszym ramieniu

chromosomu 6 (6p21.1-21.3) obejmuje sekwencję 3,8 mln par zasad, co daje 421 genów (252 geny kodowane, 139 pseudogenów)
oraz loci mikrosatelitarne. Produkty tych genów to cząsteczki HLA dzielące się na klasy:



I (HLA-A, B, Cw)



II (HLA-DP, DQ, DR)



III (C4A, C4B, Bf, C2, LTB, TNF, LTA)

Dziedziczenie HLA

Jeden zestaw (haplotyp) antygenów MHC kl. I oraz kl. II dziedziczy się w całości od każdego z rodziców zgodnie z prawami

Mendla. Allele HLA wykazują kodominujący (współdominujący) sposób ekspresji - wszystkie odziedziczone geny MHC
prezentowane są na powierzchni komórki. Dla każdego matczynego i ojcowskiego antygenu kl. I na powierzchni komórki są
antygeny kl. I. Dla każdego genu α i β kl. II na powierzchni znajdują się łańcuchy α i β, lecz mogą się one łączyć w cztery różne
cząsteczki. Istnieją również geny α i β kl. II kodujące antygeny DP i DQ.

Szansa znalezienia całkowicie zgodnego dawcy wśród:



Rodzeństwa - w zależności od rodzeństwa posiadanego przez biorcę wynosi p=1-(1-0,35)

n

) gdzie n to liczba rodzeństwa

1

.



Rodziców - mają oni jeden wspólny haplotyp, więc prawdopodobieństwo zgodności w zakresie HLA-A, HLA-B i DRB1
wynosi 2-4,5%, ale będzie mniejsze gdy rodzice są z odległych geograficznie populacji lub różnych grup etnicznych

2

.



Dzieci



Innych członków rodziny biorcy – tzw. szerokiej rodziny chorego, ale tylko w przypadku pokrewieństwa małżeństw w
rodzinie chorego

3

(p=1-(1-0,0625)

n

) lub posiadanie przez chorego przynajmniej jednego częstego haplotypu HLA

Dziedziczenie HLA w populacji:



Konserwatywne haplotypy – korzystne w generowaniu odpowiedzi odpornościowej przeciwko zespołom chorób



Nierównowaga sprzężeń – dostosowywanie się układu odpornościowego do zmieniających się układów środowiska –
dodatnia, ujemna, bloki haplotypowe.

Oznaczanie/typowanie HLA

Analiza na poziomie białka:



Typowanie serologiczne – test limfocytotoksyczny wg Terasakiego w modyfikacji NIH (National Institute of Health)



Metody biochemiczne – swoistość białek HLA na podstawie elektroforezy



Typowanie komórkowe - mieszana hodowla limfocytów – test blastogenezy (Mixed Lymphocyte Culture – MLC)

Analiza DNA



Hybrydyzacja („dot blot”, „reverse dot blot”)



PCR-RFLP – analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych produktu PCR



PCR-SSP (sequence specific primers) – metoda swoistych primerów



SSOP (sequence specific oligonucleotide probes) – metoda swoistych sond oligonukleotydowych



DNA-RSCA (reference stranded conformation analysis) – metoda konformacji z referencyjną nicią DNA



SBT (sequence based typing) – metoda sekwencjonowania

1

Myśląc o przeszczepach warto posiadać wiele rodzeństwa, co jest kwestią motywacji i możliwości rodziców chorego.

2

W takim wypadku zawsze możemy pocieszyć chorego mniejszym prawdopodobieństwem zapadnięcia na choroby o podłożu dziedzicznym, w

tym niektóre nowotwory.

3

Szczególnie skuteczne w populacjach tolerujących szeroko pojęte kazirodztwo

Test limfocytotoksyczny wg Terasakiego w modyfikacji NIH (National Institute of Health)



Dostarcza informacji o swoistości i o ekspresji komórkowej antygenów HLA



Stosowany do:

o Typowania HLA kl. I
o

Wykrywania obecności przeciwciał

o

Prób krzyżowych przed transplantacjami narządóW



Zasada testu: badany limfocyt poddajemy działaniu swoistych przeciwciał przeciwko interesującemu nam antygenowi,
po czym działamy na niego dopełniaczem. Jeśli badany antygen znajduje się na powierzchni limfocytu, dopełniacz
wywoła w nim perforację, co uwidoczniamy przez dodanie błękitu trypanu, który zabarwia komórkę w razie
pozytywnego wyniku testu.

Antygeny grup krwi



Układy grupowe i korelacje



Antygeny prywatne i publiczne



Występowanie Ag grupowych:

o

Na białkach błony erytrocyta - antygeny grupowe Rh i Kell występują wyłącznie na powierzchni błon
erytrocytów, a Ag innych grup (AB, Lewis, MNS, P) – także na powierzchni innych komórek.

o

Na białkach dopełniacza

o

Na oligosacharydach połączonych z lipidami i białkami

o Rozpuszczone w osoczu i wydzielinach



Dziedziczenie genów grupowych



Immunogenność antygenów zależy od budowy chemicznej i gęstości determinant antygenowych



Aktywność hemolityczna

o

Hemoliza wewnątrznaczyniowa

o

Hemoliza zewnątrznaczyniowa



Alloprzeciwciała:

o

Odpornościowe

o Naturalne

 Regularne
 Nieregularne – A

2

, A

2

B

Reakcja potransfuzyjna – niszczenie erytrocytów dawcy w wyniku hemolizy:



Bezpośredniej – przyłączenie przeciwciał do erytrocyta, wiązanie dopełniacza, hemoliza



Pośredniej – przyłączanie przeciwciał do erytrocyta, fagocytoza erytrocytów przez makrofagi i ich niszczenie

Układ AB0 i Rh

AB0

Rh

Geny

Ramię długie chromosomu 9

RHD i RHCE na krótkim ramieniu
chromosomu 1 (1/p34-36)

Allele

H/h, A, B, 0, allele sekrecji Se/se

RhD, RhC/c, RhE/e

Liczba Ag

4

49

Produkty genów

Enzymy – glikozylotransferazy (fukozy,
N-acetylogalaktozaminy, galaktozy)

Dwa polipeptydy

Budowa Ag

Na komórkach – glikoproteiny,
glikolipidy, w osoczu glikosfingolipidy,
w wydzielinach glikoproteiny

Polipeptydy wiążące się z białkami
szkieletu erytrocyta

Występowanie Ag

Nierozpuszczalne na erytrocytach i
innych komórkach oraz rozpuszczalne u
tzw. wydzielaczy w płynach ustrojowych
(poza OUN i PMR)

Wyłącznie na erytrocytach

Alloprzeciwciała

Naturalne regularne kompletne nie
przechodzące przez łożysko

Odpornościowe przechodzące przez
łożysko

Klasa

IgM

IgG1

Geny RHD i RHCE są wysoce homologiczne i zlokalizowane są obok siebie na chromosomie 1p34-36. Osoby Rh(-) nie

mają genu RHD, zaś Rh(+) – jedną (heterozygoty) lub dwie (homozygoty) kopie. Różnice eksonów między genami polegają na
obecności dodatkowej sekwencji w eksonie 10 genu RHD i pojedynczych zmianach nukleotydów między genami RHD i RHCE.

Oznaczanie grup krwi



Pobieranie i przygotowywanie krwi do badań serologicznych



Wykonanie badania na: szkiełkach podstawowych, płytkach szklanych, w próbówkach, w żelu – mikrometody



Zawsze do jednej kropli surowicy dodaje się jedną kroplę zawiesiny krwinek (pipeta pod kątem 45 stopni)



Interpretacja wyników – nasilenie aglutynacji wg skali Dunsforda

Mikrometody w diagnostyce immunohematologicznej



Mikropróbówki mogą być wypełnione:

o Ziarnami szklanymi (BioVuc System Ortho)
o

Żelem dekstranowym (DiaMed):

 Serologicznie obojętnym
 Z surowicą antyglobulinową
 Z surowicami diagnostycznymi



Możliwości oznaczeń:

o Grupy krwi (AB0, antygen D i inne Ag grupowe)
o

Wykrywanie alloprzeciwciał

o BTA
o

Próba zgodności



Wykonanie i interpretacja:

o

Badaną surowicę i badane krwinki nakraplamy do próbówki

o Inkubacja i wirowanie
o Cienie krwinek nad surowicą – wynik dodatni, krwinki na dole próbówki pod supernatantem z surowicy- wynik

ujemny

Wykaz używanych skrótów:

PTA – pośredni odczyn antyglobulinowy
BTA – bezpośredni odczyn antyglobulinowy
PBS – buforowany fizjologiczny roztwór NaCl
LISS – roztwór NaCl o niskiej sile jonowej 0,03mol/l
LEN – odczynnik przygotowany doraźnie: mieszanina LISS i odczynnika papainowego w stosunku 2:1
PEG – glikol polietylenowy

Metody ułatwiające aglutynację erytrocytu:



Zmniejszenie ładunku ujemnego błony erytrocytu przez trawienie jego błony enzymami



Zmniejszenie potencjału dzeta błony przez „zagęszczenie” kationów (protamina) wokół erytrocytu



Zwiększenie zasięgu ramion IgG poprzez chemiczną modyfikację regionu zawiasowego



Neutralizacja ładunku dodatniego wokół erytrocytu (albumina)

(w poniższej części sporo jest schematów do omawiania, postaram się z grubsza przybliżyć ich treść słownie)

Oznaczanie grup krwi układu AB0

W celu detekcji grupy krwi należy oznaczyć antygeny na badanych erytrocytach poprzez aglutynację z surowicami

wzorcowymi anty-A, anty-B i antyA+B, a także alloprzeciwciała w badanej surowicy poprzez aglutynację z krwinkami
wzorcowymi grup 0, A1, B, czyli per saldo wykonujemy sześć prób. Jeśli badana surowica reaguje z krwinkami wzorcowymi 0
znaczy to, że są w niej inne alloprzeciwciała nie należące do w/w układu. Nie powinny także zachodzić reakcje pomiędzy badaną
surowicą a krwinkami z grupy takiej samej, jak grupa krwinek badanych określona w pierwszej części testu.

Modyfikacja tego testu u noworodka – wykonujemy cztery próby z krwinkami noworodka:



Surowica wzorcowa antyA



Surowica wzorcowa antyB



Surowica wzorcowa antyA+B



Surowica noworodka lub surowica grupy AB – tu nie powinno być aglutynacji

Grupy krwi układu AB0 i ich odczyny z surowicami/krwinkami wzorcowymi, w teście dolichotest – patrz tabelka z katedry

Oznaczanie antygenu D z grupy Rh

Służą do tego:



Testy enzymatyczne:

o

Bez pośredni test papainowy – metoda szkiełkowa

o

Pośredni test papainowy – metoda próbówkowa LEN



Test antyglobulinowy PTA-LISS



Metody z użyciem odczynnika monoklonalnego

o

Szkiełkowa

o

Próbówkowa

o PTA-LISS



Mikrometody w żelu



Metody genetyczne (odmiany cz. Rh, ocena ryzyka konfliktu)

Alloprzeciwciała odpornościowe

Wykrywanie (w testach odpornościowych lub mikrometody):



Metody enzymatyczne LEN



Metody z użyciem surowic antyglobulinowych

o PTA-LISS
o PTA-PEG

Przygotowujemy sześć prób w środowisku LEN, w 1-4 surowica badana:



Krwinki wzorcowe 0+CCDee



Krwinki wzorcowe 0+ccDEE



Krwinki wzorcowe 0+ ccddeeK



Krwinki badane

W 5-6 standard anty-D:



Krwinki wzorcowe 0Rh+



Krwinki wzorcowe 0Rh-

Przed każdym przetoczeniem krwi wykonujemy próbę zgodności serologicznej, która obejmuje:



Kontrolę układów AB0 dawcy i biorcy



Kontrolę antygeny D u biorcy (u dawcy też – o ile biorca jest D-ujemny)



Wykonanie próby zgodności surowicy biorcy z krwinkami dawcy w teście LEN i PTA-LISS



Przeprowadzenie badań w kierunku obecności alloprzeciwciał odpornościowych w surowicy biorcy w teście LEN i PTA-

LISS



Weryfikacja wyników badań przy łóżku chorego z zastosowaniem „karty do szybkiej kontroli grupy krwi” lub

odczynników monoklonalnych do oznaczania grup krwi układu AB0 produkcji Bioscot Ltd.

4

Odległe powikłania potransfuzyjne:

Spowodowane odp. immunologiczną na
antygeny krwi

Hemoliza
Choroba „przeszczep przeciw gospodarzowi” (GVH)
Małopłytkowość

Immunomodulacja

Nie związane z odp. immunologiczną

Przeniesienie chorób zakaźnych
hemochromatoza

Badania serologiczne dawców:

Obligatoryjne:



Anty HIV 1 i 2 (p24 antygen)



HBsAg



Anty-HCV



Kiła (TPHA)

Dodatkowe:



Anty-CMV (IgM i IgG)



Anty-Toxo (IgM i IgG)



HTLV-1 – nie w Polsce

Immunologia transplantologiczna

Cząsteczki MHC klasy I (HLA-A,B) i II (HLA-DR) mogą być docelowymi antygenami odpowiedzi immunologicznej –

są to silne antygeny transplantacyjne, czyli główne Ag rozpoznawane przez organizm biorcy w procesie odrzucania przeszczepu.
Cząsteczki MHC II są głównymi Ag odpowiedzialnymi za reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi.

Do głównych ograniczeń transplantacji należą:



Dostępność narządów



Dobór antygenowy dawca-biorca



Brak w krążeniu biorcy przeciwciał przeciwko antygenom dawcy

Wskazania do przeszczepu narządów:

Nerka

Krańcowe statium niewydolności nerek

4

Reklama dźwignią handlu...

Serce

Skrajna niewydolność serca

Płuca lub płuca+serce

Nadciśnienie płucne, mukowiscydoza

Wątroba

Marskość wątroby, rak, atrezja dróg żółciowych

Rogówka

Dystrofia, zapalenie rogówki

Trzustka/wyspy Langerhansa

Cukrzyca (typu I)

Szpik kostny

Niedobór immunologiczny, białaczka

Jelito cienkie

Rak

Skóra

Oparzenia

Ustalanie zgodności tkankowej dawcy i biorcy:



Zgodność w głównych grupach krwi (AB0)

o

Erytrocyty są badane ze standardami anty-A i anty-B

o

Obecność Ab grupowych w surowicy badanej osoby określa się w teście z krwinkami 0 znanej grupy krwi tj.
grupy A i grupy B.



Typowanie tkankowe w celu określenia HLA



Próba krzyżowa w celu określenia czy surowica biorcy zawiera przeciwciała przeciwko HLA dawcy (w następstwie
wielokrotnych transfuzji, wcześniejszych transplantacji, wielu przebytych ciąż) - można wykonać test
limfocytotoksyczności zależnej od dopełniacza z wykorzystaniem limfocytów dawcy jako komórek docelowych dla Ab
obecnych w surowicy biorcy

Typy przeszczepów:



Autograft – z jednej okolicy ciała do drugiej, np. z tułowia do ramienia



Izograft – pomiędzy osobnikami identycznymi genetycznie np. bliźniakami jednojajowymi lub w obrębie szczepu
wsobnego



Allograft – pomiędzy różnymi osobnikami tego samego gatunku



Ksenograft – pomiędzy osobnikami różnych gatunków

Fazy odpowiedzi ukł. immunologicznego na obce antygeny:



Faza indukcji



Prezentacja antygenu



Rozpoznanie antygenu

W zależności od czasu trwania odrzucanie przeszczepu może być nadostre, ostre bądź przewlekłe:

Typ reakcji

Czas odrzucania

Przyczyna

Nadostra

Minuty-godziny

Wytworzone wcześniej
przeciwciała przeciw dawcy,
dopełniacz

Przyspieszona

Dni

Reaktywacja uczulonych
limfocytów T

Ostra

Dni-tygodnie

Pierwotna aktywacja limfocytów T

Przewlekła

Miesiące-lata

Różne przyczyny (Ab, KI, wolna
reakcja komórkowa, nawrót
choroby)

Działanie na przeszczep poprzez:



Komórkową reakcję cytotoksyczną – limfocyty CD8 aktywowane IL-2 i INF gamma z Th



ADCC, zmiany lityczne z zamknięciem naczyń – przeciwciała produkowane przez limfocyty B, aktywowane IL-2, 4 i
5, działanie dopełniacza



Mediatory zapalenia – dopełniacz, działanie monocytów i makrofagów stymulowanych przez TNF beta i IFN gamma



Efektem odrzucenia nadostrego i ostrego jest martwica, często połączona z masywnym krwotokiem



W odrzucaniu przewlekłym szczególna rola proliferacji kom. śródbłonka i mięśniówki gładkiej naczyń oraz procesów
włóknienia i angiodestrukcji – obrazem są zmiany podobne do miażdżycy tętnic

Konflikt serologiczny matczyno-płodowy

Zachodzi gdy dziecko odziecziczyło po ojcu antygeny grupowe nieobecne na krwinkach matki, a krwinki płodu

przedostały się do organizmu matki np. podczas krwawień matczyno-płodowych w okresie ciąży i porodu. Indukuje to
wytworzenie przez organizm matki przeciwciał przeciw krwinkom płodu, które podczas kolejnej ciąży przechodzą przez łożysko
(IgG) i niszczą krwinki płodu w mechanizmie immunofagocytozy i ADCC. Daje to powikłania w postaci niedokrwistości
hemolitycznej noworodków, ciężkiej żółtaczki noworodków oraz uogólnionego obrzęku płodu i łożyska.

Najbardziej immunogennym z antygenów Rh jest antygen D odpowiedzialny za większość przypadków choroby

hemolitycznej noworodków (1-5/1000 żywo urodzonych noworodków). Zaraz po nim lokują się antygeny K, c i E. Typowe
układy mogące powodować konflikt serologiczny to:

Układ

Ojciec

Dziecko

Matka

Rh

D

D

D

CDE

CDE

ccddee

AB0

A

A

0

B

B

0

Kell

Kell+

Kell+

Kell-

Duffy

Fya

Fya

Fyb

MNSs

S

S

s

Choroba hemolityczna noworodków w układzie AB0 jest wywołana przeciwciałami matczynymi anty-A i anty-B, jest

częstsza niż izoimmunizacja Rh, ale ma łagodniejszy przebieg i nie nasila się podczas kolejnych ciąż. Ukłąd gdy matka jest 0 a
dziecko A lub B występuje w 15% ciąż, ale tylko w 3% rozwija się ChHN. Hemoliza krwinek zaczyna się w ostatnich tygodniach
ciąży i jest słabo wyrażona klinicznie – żółtaczka zwykle w 2 dobie życia, w rozmazie mikrosferocytoza. Niezgodność w układzie
AB0 chroni przed immunizacją w układzie Rh – zanim dojdzie do prezentacji antygenów D, C, E płodu limfocytom matki,
dochodzi do eliminacji erytrocytów płodu z krwi matki.
Na rozpoznanie ChHN składa się:



Jakościowe i ilościowe badanie serologiczne przeciwciał we krwi i płynie owodniowym.



Badanie hematologiczne, ocena stopnia niedokrwistości płodu we krwi pępowinowej pobranej w trakcie kordocentezy



Badanie USG (ocena wykładników obrzęku płodu, przepływ w tętnicy środkowej mózgu)



Badanie biochemiczne stężenia bilirubiny w płynie owodniowym poprzez ocenę gęstości optycznej

Profilaktyka konfliktu serologicznego

Podane przeciwciała anty-D blokują determinanty antygenowe na powierzchni erytrocytów, jednak stosowana dawka

pozwala na zasłonięcie zaledwie kilkudziesięciu procent antygenu D. Jednak przeciwciała te mogą także stymulować odpowiedź
antyidiotypową, hamującą wytwarzanie przeciwciał anty-D, a IgG wiążąc antygen mogą hamować inicjację odpowiedzi
humoralnej przekazując sygnał supresyjny limfocytom B poprzez FcγRIIB.

Diagnostyka serologiczna

Bezpośredni test antyglobulinowy (BTA) – erytrocyty chorego opłaszczone in vivo przeciwciałami poddajemy działaniu

p/ciał przeciwko ludzkiej IgG, aglutynacja oznacza wynik dodatni. Wykorzystanie diagnostyczne – u noworodków z
podejrzeniem ChHN i u chorych z podejrzeniem niedokrwistości autoimmunohemolitycznej (NAIH), a także u biorców krwi w
badaniach powikłań poprzetoczeniowych.

Pośredni test antyglobulinowy (PTA) – erytrocyty zdrowego dawcy inkubowane z surowicą chorego poddajemy

działaniu p/ciał przeciwko ludzkiej IgG, aglutynacja oznacza obecność p/ciał przeciw krwinkom dawcy i wynik dodatni.
Zastosowanie – wykrywanie alloprzeciwciał odpornościowych we krwi ciężarnych oraz biorców i dawców krwi. Modyfikacją
testu jest jego wykonanie w środowisku glikolu polietylenowego. Związek ten:



Wzmacnia reakcję antygen-przeciwciało



Zwiększa szanse wykrycia śladowych ilości alloprzeciwciał w teście PTA-PEG



Ułatwia formowanie kompleksów immunologicznych



Wypiera z roztworu cząsteczki mogące być przyczyną reakcji nieswoistych.

Test wykonujemy jak powyżej w punkcie „Alloprzeciwciała odpornościowe”, z tym że w środowisku PEG.