Immunologia - prelekcja 5.11.2007

Metody immunologiczne z zastosowaniem znaczników.

Służą one oznaczaniu substancji o charakterze białkowym w płynach ustrojowych. Poszukiwany związek może być zarówno przeciwciałem jak i antygenem. Ogólna zasada wszystkich metod polega na tym, że jeden ze składników kompleksu Ag-Ab wyznakowany jest znacznikiem (markerem). Rodzaj tego znacznika dzieli metody na:

• Fluorymetryczne - znacznikiem jest fluorochrom - barwnik fluoryzujący w świetle o krótkiej fali (zielony, żółty, czerwony)

• Radioimmunometryczne (RIA) - znacznikiem jest pierwiastek promieniotwórczy

• Immunoenzymatyczne (EIA) - znacznikiem jest enzym

• Chemiluminescenscyjne - znacznikami są określone substancje organiczne

Metody fluorymetryczne

Barwnikami są:

• Izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) - reaguje na światło zielone

• Izotiocyjanian rodaminy B (RITC) - reaguje na światło czerwone

Emisję wzbudza wiązka światła o małej długości fali, aby ją uzyskać stosujemy:

• Filtry przepuszczające promieniowanie indukujące fluorescencję

• Filtry usuwające promieniowanie niepożądane

Metoda bezpośrednia

Jeden ze składników kompleksu (antygen) jest związany z fazą stałą (tkanki, komórki, powierzchnia płytki polistyrenowej, kulki poliakrylamidowe), stanowi materiał poszukiwany. Dodajemy znakowane przeciwciało swoiste dla antygenu doprowadzając do wytworzenia kompleksu Ag + AbF*, o czym mierzymy fluorescencję tego kompleksu.

Metody pośrednie

Antygen związany jest z fazą stałą, poszukujemy przeciwciała. Najpierw dodajemy do mieszaniny reakcyjnej badanego materiału, a potem znakowanego przeciwciała antyglobulinowego skierowanego przeciw poszukiwanemu przeciwciału. Zalety metod pośrednich to:

• Większa czułość i swoistość w porównaniu do metod pośrednich

• Uniknięcie możliwości zmian swoistości przeciwciała podczas znakowania

Odmianą metod pośrednich są tzw. metody „kanapkowe” (ang. „sandwich”), w których oznaczany materiał jest antygenem. Do związanego z fazą stałą przeciwciała dodajemy badanego materiału, po czym inkubujemy próbkę i dodajemy znakowanych przeciwciał przeciwko poszukiwanej substancji. Nadmiar znakowanych przeciwciał odpłukujemy po czym oceniamy fluorescencję kompleksów Ab-Ag_Ab* związanych z fazą stałą.

Metody radioimmunologiczne (RIA)

Polegają one na wykrywaniu reakcji Ag- swoiste Ab poprzez pomiar promieniowania izotopów promieniotwórczych związanych z jednym ze składników kompleksu. Najczęściej stosowane znaczniki to izotop ¹²⁵J i tryt ³H.

Metoda kompetycyjna

Przebiega w dwóch etapach:

• W pierwszym wyznakowany izotopem antygen łączy się z dodanym w niedoborze wolnym przeciwciałem w kompleksy Ab-Ag* które odpłukujemy i mierzymy radioaktywność mieszaniny reakcyjnej, proporcjonalną do ilości nie związanego znakowanego antygenu w roztworze.

• W drugim etapie do badanego materiału (z badanym Ag) dodajemy takie same ilości znakowanego Ag* oraz przeciwciała (w niedoborze). Zachodzi konkurencja o przeciwciało pomiędzy Ag i Ag*, a stosunek kompleksów Ab-Ag do Ab-Ag* zależy od ilości Ag w badanym materiale. Im jest go więcej tym więcej „odbiera” on przeciwciała Ag*, które po odpłukaniu kompleksów immunologicznych pozostaje w roztworze w większej ilości niż w pierwszym etapie, wzmagając jego radioaktywność. Stężenie badanego Ag oceniamy poprzez pomiar radioaktywności supernatantu mieszaniny reakcyjnej i odnosząc wynik do uzyskanego w pierwszym etapie. Im więcej badanego antygenu tym zwiększa się radioaktywność supernatantu w drugim etapie reakcji.

Metoda immunoradiometryczna

Jeden ze składników reakcji związany jest z fazą stałą. Może to być plastikowa próbówka bądź mikropłytka którą opłaszczamy nie znakowanymi przeciwciałami, po czym dodajemy badanego materiału (poszukujemy antygenu), a po inkubacji - znakowanego przeciwciała, uzyskanego przez immunizację innego gatunku ludzkim poszukiwanym antygenem i inkubujemy ponownie. Nadmiar nie związanych przeciwciał odpłukujemy, po czym mierzymy radioaktywność na płytce bądź w próbówce.

Zastosowanie metod RIA

• Ilościowe oznaczanie antygenów lub przeciwciał

• Oznaczanie stężenia hormonów w płynach ustrojowych

• Wykrywanie obecności białek towarzyszących nowotworom (np. antygenu rakowo-płodowego i alfa-fetoproteiny)

• Oznaczanie ilości swoistych przeciwciał klasy IgE w alergiach

• Oznaczanie stężenia witamin i leków

• Wykrywanie obecności autoprzeciwciał w schorzeniach autoimmunologicznych

W oparciu o techniki immunoradiometryczne opracowano dwa testy do oznaczania poziomu IgE o danej swoistości w surowicy , oraz poziomu IgE w alergologii:

• RAST (RadioAlergoSorbent Test)

• RIST (RadioImmunoSorbent Test)

Metody immunoenzymatyczne (EIA)

Znacznikiem jednego ze składników reakcji jest enzym. Produkt reakcji katalizowanej przez enzym jest barwnym a oznaczamy go metodami spektrofotometrycznymi. Metody te charakteryzują się wysoką czułością oraz brakiem konieczności stosowania pierwiastków promieniotwórczych co daje im przewagę nad metodami RIA.

Stosowane enzymy muszą spełniać takie warunki jak:

• Rozpuszczalność

• Stabilność

• Łatwe i trwałe wiązanie się z białkiem

• Nieobecność (lub występowanie w śladowych ilościach) w płynach ustrojowych

• Łatwo dostępne substraty

• Barwne produkty reakcji

Najczęściej stosujemy:

• Peroksydazę chrzanową (HRP)

• Fosfatazę alkaliczną (AP)

• Oksydazę glukozową (GO)

Substratami dla enzymów są H₂O₂ i związek chromogenny, dające w efekcie działania enzymu zmianę zabarwienia.

Najczęściej stosowane chromogeny to:

• Ortofenylodiamina (OPD)

• Orto-dwuanizydyna

• Kwas 5-aminosalicylowy (PAS)

• P-nitrofenylofosforan sodowy

Metoda EIA pośrednia

Jest to metoda w której poszukujemy antygenu.

Reakcja przebiega w kilku etapach:

• Połączenie poszukiwanego Ag ze swoistym przeciwciałem, inkubacja, płukanie

• Dodanie przeciwciała antyglobulinowego przeciwko Ab znakowanego enzymem, inkubacja, płukanie

• Dodanie H₂O₂ i chromogenu, reakcja barwna

Metoda ta ma różne modyfikacje. Najczęściej są to reakcje trójstopniowe, co zwiększa czułość metody. Dzięki EIA możemy także oznaczać przeciwciała, w tym celu wykorzystujemy odpowiednie antygeny związane np. ze ściankami próbówki bądź mikropłytką.

Test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Zastosowanie testu:

• Wykrywanie obecności w płynach biologicznych antygenów i przeciwciał w chorobach zakaźnych i pasożytniczych

• Ocena ilościowego stężenia hormonów

• Wykrywanie obecności autoantygenów.

Metody chemiluminescencyjne

Są oparte na pomiarze emisji fotonów w przebiegu reakcji chemicznej. Jeden z reagentów oznakowany jest substancją organiczną - lucyferyną lub estrem akrydyny. W przebiegu znacznikowej reakcji chemicznej zachodzi emisja promieniowania w zakresie światła widzialnego, które mierzymy za pomocą luminometru. Emisja fotonów trwająca kilka sekund przetwarzana jest na liczbę impulsów na minutę. Technika ta stosowana jest do ilościowego pomiaru tak antygenu jak i przeciwciała.

Metody immunomorfologiczne (IF)

Dzielą się one na:

• Metody immunofluorescencyjne - znacznikiem są flurorchromy

• Metody immunoenzymatyczne - znacznikiem są enzymy

• Z użyciem metali szlachetnych jako znacznika - wykorzystujemy np. roztwór koloidalny złota otrzymywany z kwasu chlorozłotawego za pomocą reduktorów (aldehyd mrówkowy, kwasy organiczne)

Materiał do badań stanowią:

• Wycinki tkanek (bioptaty)

• Zawiesina żywych komórek (krew)

• Zawiesina żywych bakterii

Preparaty ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym.

Metoda immunomorfologiczna bezpośrednia

Znakowane jest przeciwciało, poszukujemy antygenu w badanym materiale, np. wykrywanie antygenu Chlamydia trachomatis w wymazach z kanału szyjki macicy.

Metoda immunomorfologiczna bezpośrednia

Przebiega w dwóch etapach:

• Inkubacja poszukiwanych nieznakowanych przeciwciał swoistych z antygenami

• Identyfikacja utworzonych kompleksów po dodaniu znakowanych przeciwciał antyglobulinowych

Jest to metoda czulsza od IF pośredniej.

Dwubarwna reakcja immunofluorescencji

Wykorzystujemy dwa fluorochromy emitujące światło o różnych barwach, co pozwala nam na ocenę w preparacie dwóch różnych antygenów. Reakcja przebiega w kilku etapach:

• Badany materiał inkubujemy ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla pierwszego antygenu (np. p/ciała przeciw białku SpoIIAB znakowane FITC, dającym kolor zielony)

• Następnie inkubujemy próbkę ze znakowanymi przeciwciałami swoistymi dla drugiego antygenu (np. anty DNA znakowane RITC, dającym kolor czerwony)

Wynikiem reakcji jest dwukolorowy preparat oceniany w mikroskopie fluorescencyjnym.

Zastosowanie - np. wykrywanie komórek Baccillus subtilis przekształcających się w przetrwalniki.

Technologia BIOCHIP

Wycinki tkanek, hodowle komórek lub rozmazy bakterii są umieszczane na cieniutkich płytkach szklanych, które są dzielone na milimetrowej wielkości fragmenty (BIOCHIPy), które są przyklejane automatycznie do szkiełek mikroskopowych. Technologię tą można wykorzystać do wykrywania w jednej próbce przeciwciał przeciwko kilku antygenom.

Metoda ta znalazła zastosowanie w diagnostyce infekcji układu oddechowego tak bakteryjnych:

• Botredella pertussis i parapertussis

• Haemophilus influenzae

• Leginonella pneumoniae

• Klebsiella pneumoniae

• Chlamydia trachomatis

• Chlamydophila pneumoniae

Jak i wirusowych:

• Herpes simplex virus 1

• Wirusy oddechowe

• Adenovirus

• Influenza A i B virus

• Parainfluenza virus 1-4

• Coxsackie (A7, A9, A16, A24, B1 do B6)

Metody immunomorfologiczne immunoenzymatyczne (EIA)

Analogicznie do w/w testów immunoenzymatycznych, w metodach tych do znakowania przeciwciał stosuje się enzymy katalizujące reakcje dające barwne produkty. Detekcji kompleksów dokonuje się za pomocą metod immunohistochemicznych. Są to metody jakościowe. Stosowane enzymy muszą spełniać takie same kryteria jak w przypadku testów immunoenzymatycznych, stąd też w metodach tych najczęściej stosuje się wyżej wymienione enzymy (peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, oksydazę glukozową), natomiast stosowane chromogeny to:

• Tetrachlorowodorek 3,3-dwuaminobenzydyny (DAB) - daje ciemnobrązowy produkt nierozpuszczalny w wodzie.

• 3-amino-9-etylokarbazol (AEC) - daje czerwony produkt nierozpuszczalny w wodzie, rozpuszczalny w alkoholu.

Reakcja peroksydaza-antyperoksydaza (PAP)

Składa się z dwóch etapów:

• W pierwszym etapie wykrywamy antygen swoistym przeciwciałem

• W drugim etapie dodajemy p/ciał znakowanych enzymem peroksydaza-antyperoksydaza związanych za pomocą mostka - wiążą się one z kompleksem Ab-Ag poprzez warstwę pośrednią nieznakowanych p/ciał reagujących z przeciwciałem pierwotnym oraz kompleksem enzym-antyenzym

• W trzecim etapie dodajemy H₂O₂ i związek chromogenny

• W czwartym etapie odczytujemy wynik reakcji - obecność poszukiwanego antygenu oceniamy na podstawie wyniku badanej reakcji - obecności lub braku brązowego (lub innego koloru) barwnika (zależy od chromogenu).

Zastosowanie metody to wykrywanie markerów nowotworowych w tkankach:

Typ nowotworu	Marker wykrywany immunoenzymatycznie
Mięsak gładkokomórkowy okrężnicy	Przeciwciała przeciwaktynowe
Łagodny przerost gruczołu krokowego	Receptory androgenowe
Rak przewodów żółciowych	Receptory Bcl-X
Chłoniak pochodzący z limf. T	CD3
Chłoniak Hodgkin'a	CD15
Rakowiak (nowotwór okresu płodowego)	Chromogranina A
Chłoniak	CPP32
Złośliwy międzybłoniak pochodzący z nowotworu błony surowiczej	Cytokeratyna 5/6
Rak piersi	Receptor estrogenowy
Czerniak złośliwy	Kompleksy melaniny A

Reakcja fosfataza alkaliczna - antyfosfataza alkaliczna (APAAP)

Zasada metody jest podobna do reakcji PAP, różni się jedynie wykorzystywanym kompleksem. Zastosowanie metody jest bardzo podobne, służy ona do wykrywania obecności antygenów w tkankach. Barwne, czerwone produkty reakcji są dobrze widoczne w mikroskopie świetlnym.

Zastosowanie metody:

Typ nowotworu	Marker wykrywany immunoenzymatycznie
Anaplasyczny chłoniak olbrzymiokomórkowy	CD30
Łuskowaty rak skóry	Nabłonkowy cz. wzrostu EGFR
Chłoniak obwodowy wyw. z limfocytów T	Granzym B

Reakcje z układem biotyna-awidyna

W metodzie tej wykorzystuje się wysokie powinowactwo biotyny (nisko cząsteczkowej wit. H) do zasadowej glikoproteiny białka jaja kurzego - awidyny. Czasem zamiast awidyny wykorzystuje się streptawidynę, izolowaną z bakterii Streptomyces avidini.

Cytometria przepływowa

Jest to nowoczesna metoda badawcza służąca do wieloparametrowej oceny komórek układu krwiotwórczego. Pozwala ona na jednoczesne określenie:

• Komórek krwi na podstawie ich wielkości i granularności (populacje erytrocytów, granulocytów, limfocytów, monocytów i trombocytów)

• Różnych rodzajów antygenów różnicowania (CD) i innych poprzez użycie przeciwciał monoklonalnych znakowanych różnymi fluorochromami.

Warunkiem wykonania analizy cytometrycznej jest doprowadzenie posiadanego materiału do zawiesiny pojedynczych komórek. Przy pobieraniu krwi do badań cytometrycznych stosujemy odpowiedni antykoagulant:

• EDTA i heparyna - dla pełnej krwi

• Hirudyna - dla szpiku kostnego

W uzyskanej zawiesinie komórek należy określić ich żywotność. Po dokonaniu analizy można komórki sortować na poszczególne frakcje stosując odpowiednie urządzenie pomiarowe, tzw. sorter komórek.

Zasada metody polega na tym, że komórki kierowane są do kanału w strumieniu cieczy pojedynczo, po czym wiązka niebieskiego bądź ultrafioletowego światła oświetla przepływające komórki, ulegając ugięciu i rozproszeniu, a jeśli komórki zostały wyznakowane znacznikiem fluorescencyjnym, także wzbudzając fluorescencję. Źródłem światła są lasery lub rtęciowe lampy wysokociśnieniowe. Światło ugięte i rozproszone, a także fluorescencyjne zbierane jest przez odpowiednio dopasowany układ optyczny, przesyłający je poprzez filtry zaporowe do detektorów. Następnie dołączony system automatyki, sterowania oraz komputer zbiera i przetwarza uzyskane dane, co pozwala na ocenę parametrów co najmniej 100 komórek na sekundę. Liczba mierzonych parametrów zależy od rodzaju przyrządu.

Wykorzystywane w tej metodzie barwniki to fikobiliproteiny:

• Fikoerytryna B, fikoerytryna R (światło czerwone)

• Fikocyjanina C, fikocyjanina R (światło fioletowe)

• Allofikocyjanina (światło zielone)

Do oznaczania DNA w komórce stosowany jest jodek propidyny.

Techniką cytometrii przepływowej możemy:

• Określić liczebność populacji komórek w badanym materiale

• Określić cechy morfologiczne (fenotyp) badanych komórek

• Ocenić stan czynnościowy komórek

• Oznaczyć stopień ekspresji antygenu na powierzchni komórek

• Oznaczać ilościowo niektóre białka (cytokiny)

Wyznaczanie powyższych parametrów jest przydatne w diagnostyce klinicznej - umożliwia monitorowanie stanu immunologicznego w trakcie choroby i leczenia.

• Określić fenotyp komórek blastycznych w białaczkach ostrych

• Diagnozować:

- chłoniaki

- białaczki przewlekłe

- zespoły mielodysplastyczne (MDS)

• Oceniać DNA w komórkach białaczkowych

• Poszukiwać choroby resztkowej (MRD)

• Oceniać molekułę lekooporności (MDR)

• Monitorować pacjentów po przeszczepach allogenicznych i szpiku

• Badać komórki krwiotwórcze, retikulocyty i erytrocyty

• Oceniać morfologicznie i czynnościowo płytki krwi

• Określać jakościowo i ilościowo niedobory odpornościowe, oznaczać ilościowo klasy i podklasy immunoglobulin

• Diagnozować AIDS przez ocenę limfocytów CD4

• Wykrywać erytrocyty płodu we krwi matki

• Oznaczać ilościowo cytokiny

Najczęściej stosowane markery to:

• CD45 leukocytów

• CD3 limfocytów

• CD19 i CD20 limfocytów B

• CD15 neutrofili

• CD16 i CD56 komórek NK

---