REKOMBINOWANIE I

KLONOWANIE DNA,

ANALIZA I

ZASTOSOWANIE

KLONOWANEGO DNA.

KONRAD CABAŁA

ENZYMY
RESTRYKCYJNE

Enzymy należące do endonukleaz. Tną DNA w miejscu
specyficznych sekwencji dając fragmenty o zdefiniowanej długości.

TYP I
•Tnie obie nici DNA w odległości ok. 1000 – 5000 pz od
rozpoznania specyficznej sekwencji. Uwalnia fragment złożony z
kilkudziesięciu nukleotydów;

TYP II
•Tnie obie nici w miejscu rozpoznania specyficznej sekwencji
(sekwencje palindromowe), tylko one znalazły zastosowanie
w inżynierii genetycznej;

TYP III
•Mechanizm przecięcia podobny do TYPU II; bez zastosowania
praktycznego.

TYPY CIĘĆ RESTRYKTAZ
TYPU II

Przecięcie nici na tej samej

wysokości – tępe końce

5’ . . . G T T A A C . . . 3’
3’ . . . C A A T T G . . . 5’

Enzym Hha I

Przecięcie nici niesymetryczne –

lepkie końce

5’ . . . G A A T C C . . .
3’
3’ . . . C T T A G G . . .
5’

Enzym Eco RI

WEKTORY

Wektor to element służący do wprowadzenia obcego DNA
do komórki gospodarza.

PODZIAŁ WEKTORÓW

Stosowane w komórkach

prokariotycznych

Stosowane w komórkach

eukariotycznych

Plazmidy

Kosmidy

Bakteriofagi

Plazmid Ti Wirus

SV40

Retrowirusy

WEKTORY STOSOWANE W
KOMÓRKACH
PROKARIOTYCZNYCH

Plazmid

bakteryjny

Wprowadzany na drodze

transformacji, zdolny do

samoreplikacji.

Wstawka

wielkości ok. 15

kpz.

Wirus fagowy

Infekuje bakterie przez

aktywne wstrzyknięcie

swojego DNA, duża

wydajność infekcji.

Wstawka

wielkości ok. 25

kpz.

Kosmid

Infekuje jak fag λ, a

replikuje jak plazmid,

stosowany przy

klonowaniu operonów,

genów eukariotycznych.

Wstawka

wielkości ok.

45kpz.

Schemat:
Klonowanie DNA
za pomocą
kosmidu.

WEKTORY STOSOWANE W
KOMÓRKACH
EUKARIOTYCZNYCH

Plazmid Ti

Pochodzi z Agrobacterium

tumefaciens.

Stosowany w transfekcji komórek

roślinnych.

Wirus SV40

Najdawniej wykorzystywany. Kolista

dwuniciowa cząsteczka DNA.

Wykorzystywany do uzyskiwania

linii komórek o cechach

nowotworowych.

Retrowirusy

Genom stanowi jednoniciowa

cząsteczka RNA, która koduje białka

otoczki oraz odwrotną

transkryptazę. Wysoka wydajność

transfekcji.

Schemat:
Klonowanie
genu w
komórkach
eukariotycznyc
h
w wektorze
pochodnym
retrowirusa.

KLONOWANIE DNA

Klonowanie to sposób amplifikacji fragmentu
DNA, dzięki któremu powstaje wiele
identycznych kopii określonego odcinka DNA.
Proces klonowania przebiega w kilku etapach.

1. Trawienie DNA

analizowanego
i wektora tym
samym enzymem
restrykcyjnym,

2. Ligacja,

3. Wprowadzenie

zrekombinowanego
wektora do komórki
biorcy *,

4. Wysiew na podłożu,

5. Powstanie klonów.

ETAPY
KLONOWANIA

* WBUDOWANIE WEKTORA DO
KOMÓREK BIORCY

TRANSFORMACJA zjawisko i proces aktywnego pobierania
DNA, zwykle plazmidowego DNA. Pobrane DNA ulega
rekombinacji z homologicznymi komórkami DNA w
chromosomie biorcy.

Uzyskiwanie komórek kompetentnych.

•Inkubacja w roztworze bogatym w jony wapnia,

•Niska temperatura (4⁰C) Szok cieplny (37-42⁰C).

•Elektroporacja

•Bombardowanie kulkami ze złota lub wolframu.