Fosforylaza

glikogenu

(EC 2.4.1.1)

Kwapis Małgorzata

Graczykowska Flora

Plan

prezentacji

1. Fosforylaza glikogenu
2. Glikogen
3. Przykłady reakcji enzymatycznych
4. Mechanizm reakcji enzymatycznej na wybranym

przykładzie

5. Inhibitory reakcji
6. Sposoby określania aktywności enzymu
7. Otrzymywanie fosforylazy glikogenowej
8. Sposoby wyznaczania stałych Vmax, KM
9. Źródło otrzymywania enzymu
10. Zastosowanie enzymu

Fosforylaza glikogenu

Fosforylaza glikogenu (ang. glycogen

phosphorylase) – to enzym klasy transferaz,

katalizujący odłączanie cząsteczek glukozy (w

postaci glukozo-1-fosforanu) od łańcucha glikogenu

w procesie fosforolizy, czyli pierwszym etapie

glikogenolizy. To odłączenie glukozo-1-fosforanu

nazywa się fosfolitycznym rozszczepieniem

glikogenu i jest korzystne energetycznie, gdyż

związek ten wchodząc w przemiany glikolityczne,

nie musi być ufosforylowany, tym samym nie

zużywa cząsteczki ATP. Fosforylaza glikogenu może

usuwać tylko te reszty glukozy, które są oddalone

od miejsca rozgałęzienia o więcej niż cztery reszty

glukozy. Działa ona do chwili gdy produktem

końcowym jest cząsteczka zbudowana z ośmiu

glukoz.

Struktura fosforylazy

glikogenu

Transferazy

Transferazy to klasa enzymów

katalizujących reakcję

przeniesienia grupy chemicznej

lub atomu z jednej cząsteczki

(donora) na drugą (akceptora),

co można zobrazować:

AB + C --> A + BC

Glikogen ( -(-C

6

H

10

O

5

-)-

n

)

To polisacharyd (wielocukier), którego cząsteczki

zbudowane są z połączonych reszt glukozy.
W organizmach zwierzęcych jest gromadzony

w wątrobie, w mniejszym stężeniu

występuje też w tkance mięśniowej.

Glikogen

• Jest to zwierzęcy odpowiednik skrobi, polimer

α-D-glukanu o wiązaniach α-1,4-glikozydowych

z częstymi rozgałęzieniami wiązań

α-1,6-glikozydowych; bardzo dużo rozgałęzień,

stosunkowo łatwo rozpuszczalny w wodzie.

• Jest głównym wielocukrem stanowiącym

materiał zapasowy w komórkach zwierzęcych.

Ma strukturę podobną do amylopektyny, tylko,

że jego cząsteczki są bardziej rozgałęzione i jego

łańcuchy są krótsze. Rozgałęzienie następuje co

8-12 reszt glukozy. Glikogen w miarę potrzeby

może być szybko rozkładany do glukozy. Do

najbogatszych w ten materiał zapasowy

narządów należą wątroba, mięśnie i mózg.

Ogólny zarys

metabolizmu glikogenu

Przykłady reakcji

enzymatycznych

Mechanizm rekcji

enzymatycznej

Mechanizm rekcji

enzymatycznej

Związana grupa HPO

42-

umożliwia

zerwanie wiązania glikozydowego
przez oddanie protonów do reszty
glukozy odcinanej od cząsteczki
glikogenu. Tworzy się karbokation,
który w połączeniu z
ortofosforanem prowadzi do
utworzenia glukozo-1-fosforanu.

Sposób określania

aktywności enzymu

Wyznaczanie i sposoby wyrażania aktywności enzymów wymaga
konieczności znajomości i stosowania optymalnych warunków
przebiegu reakcji katalizowanej przez dany enzym:

a/ Km - stosuje się wysycające stężenia substratów - [S]  Km

b/ niezbędne kofaktory - indywidualny dobór rodzaju i stężeń
c/ pH - indywidualna zależność
d/ temperatura (T) - zasadniczo jednakowa zależność dla

większości enzymów z maksimum aktywności dla około

40oC

e/ jednostki aktywności:

jednostki międzynarodowe (IU, U): 1U to aktywność

wytwarzająca 1mol produktu/min

katale: 1kat to aktywność wytwarzająca 1 mol produktu/s;

1katal=6107 U, 1U=16.67 nKat

Sposób określania

aktywności enzymu

Aktywność enzymatyczna może być
zatrzymana lub obniżona przez inne
cząsteczki – inhibitory. Wiele leków i
trucizn jest inhibitorami enzymów. Z
kolei aktywatory enzymatyczne to
cząsteczki zwiększające aktywność
enzymów. Ponadto aktywność enzymów
zależy od parametrów fizykochemicznych
środowiska reakcji, takich jak:
temperatura, pH, siła jonowa, obecność
niektórych jonów i innych.

Sposób określania

aktywności enzymu

Katalityczna aktywność enzymu jest wybiórczą i czułą próbą ich
detekcji

Sposób określania

aktywności enzymu

Sposoby określania

aktywności enzymów

Oznaczona szybkość reakcji jest
proporcjonalna do ilości
obecnego enzymu.
Ilość enzymu wyrażana jest
jednostkach enzymatycznych.

Mechanizm aktywacji

fosforylazy

Otrzymywanie

fosforylazy glikogenowej

Na masową skalę fosforylazę otrzymywana jest z bakterii
(gł. Escherichia coli), po uprzednim wprowadzeniu genu
kodującego ten enzym do ich komórek. Hodowla bakterii
jest prowadzona w tzw. chemostacie, w którym panują
stałe warunki hodowli umożliwiające ciągłe otrzymywanie
bakterii o takich samych własnościach. Zazwyczaj
wprowadzany do bakterii gen kodujący enzym jest
dodatkowo opatrzony w odpowiedni promotor, znacznie
zwiększający ekspresję tego genu, co umożliwia
nadprodukcję fosforylazy. Jest to niezwykle istotne,
ponieważ dzięki takiemu zabiegowi produkowany enzym
występuje w bardzo dużej przewadze liczbowej w stosunku
do innych białek występujących w komórce bakterii.

Otrzymywanie

fosforylazy glikogenowej

Fosforylaza glikogenowa może być
także otrzymywana z mięśni
szkieletowych oraz mięśnia sercowego
królika (pierwszy raz 1943r.), mięśni
raka (1962r.), mięśni skrzydeł owadów
lotnych (1970r.), psiej, świńskiej oraz
króliczej wątroby (1966r.). Fosforylaza
otrzymana z Escherichia coli pierwszy
raz została wyizolowana w 1967r.

Sposoby wyznaczania

stałych V

max

i K

m

Mechanizm katalizowanej reakcji z udziałem jednego substratu
E – enzym, S – substrat, P – produkt, k

1

i k

2

– stałe szybkości reakcji

przebiegających w prawą stronę,
k

-1

i k

-2

– stałe szybkości reakcji zachodzących w lewą stronę.

W założeniach modelu kinetyki Michaelis-Menten zakłada się, że
produkt (P) nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy
substrat, w reakcji ze stałą szybkości k

-2

Sposoby wyznaczania

stałych V

max

i K

m

Jeżeli enzym działa wg
wcześniejszego schematu, Stała
Michaelisa i szybkość maksymalna
wyprowadzane są z szybkości
katalizy, mierzonych przy różnych
stężeniach substratu.
Obecnie w tym celu stosuje się
komputerowe programy dobierania i
dopasowywania krzywych.

Sposoby wyznaczania

stałych V

max

i K

m

Szybkość maksymalna

V

max

V

max

= k

2

*[E]

T

K2- stała szybkość reakcji rozpadu

kompleksu ES

[E]

T

- całkowite stężenie enzymu

Stała Michaelisa

Stała Michaelisa (K

m

) - jest to takie

stężenie substratu, przy którym szybkość
reakcji enzymatycznej jest równa połowie
szybkości maksymalnej (V

max

) tej reakcji.

Stała ta jest wyrażana w molach na dm

3

i

określa powinowactwo enzymu do substratu:
im jest mniejsza, tym powinowactwo jest
większe, natomiast duża wartość tej stałej
mówi o małym powinowactwie enzymu do
substratu.
Wartość stałej K

m

dla większości enzymów

przyjmuje wartości z zakresu 10

-3

do 10

-5

mol/dm

3

Stała Michaelisa

Co wpływa na stałą Michaelisa:
• rodzaj i stężenie substratu
• pH
• temperatura
• siła jonowa

K

M

= ([E][S])/[ES]

Stała Michaelisa

Zastosowanie fosforylazy

glikogenowej

Koenzym fosforylazy glikogenowej
stosowany jest jako składnik
niektórych preparatów
witaminowych, głównie witaminy B6
(np. Magvit B6), gdyż wpływa na
wzrost stężenia glukozy w mięśniach.

Formy fosforylazy,

zastosowanie

Fosforylaza glikogenu występuje w ludzkim organizmie w

trzech różnych formach:

–

wątrobowa – GPLL (Liver),

–

mięśniowa – GPMM (Muscle),

–

sercowo-mózgowa – GPBB (Brain/Heart).

U ludzi gen kodujący GPMM położony jest na

chromosomie 11, GPLL – na chromosomie 14, a GPBB –

na chromosomie 20. Mutacje w genach kodujących

fosforylazy glikogenu mogą powodować choroby

spichrzeniowe glikogenu.
Przy zawale serca dochodzi do podwyższenia poziomu

GPBB. Enzym ten przechodzi bezpośrednio do układu

krążenia i jest już w pierwszej godzinie po wystąpieniu

bólu w klatce piersiowej wykrywalny w wysokim stężeniu.

Pierwsze badania kliniczne wskazują, że może to

byćbardzo szybki i pewny sposób diagnozy zawału serca.

Bibliografia

• „Biochemia”, Jeremy M. Berg, John L.

Tymoczko, Lubert Styer, Wydawnictwo

Naukowe PWN, Warszawa 2005

• „Biochemia Harper'a”, R.K.Murray,

D.K.Granner, P.A.Mayes, V.W.Rodwell, 2006

• e-źródło: Biochemistry, 2007, 46 (43), pp

12405–12415, pdf

• e-źródło: „Słodki świat enzymów”, Takao

Ishikawa, Anna Karnkows, Joanna Lilpop,

Jakub Urbański, pdf

Dziękujemy za uwagę

Małgorzata Kwapis

Flora Graczykowska

Biotechnologia, CH1