Pomiary fluorescencji

Pomiary fluorescencji

chlorofilu –

chlorofilu –

uniwersalne

uniwersalne

narzędzie biologii

narzędzie biologii

roślin

roślin

Plan wykładu:

Plan wykładu:

1.

1.

Charakterystyka zjawiska fluorescencji

Charakterystyka zjawiska fluorescencji

2.

2.

Fluorescencja chlorofilu

Fluorescencja chlorofilu

3.

3.

Techniki pomiaru fluorescencji chlorofilu w

Techniki pomiaru fluorescencji chlorofilu w

liściach

liściach

1.

1.

Pomiary szybkiej kinetyki fluorescencji chlorofilu w

Pomiary szybkiej kinetyki fluorescencji chlorofilu w

liściach zaadaptowanych do ciemności; JIP-test

liściach zaadaptowanych do ciemności; JIP-test

2.

2.

Pomiary modulowanego sygnału fluorescencyjnego

Pomiary modulowanego sygnału fluorescencyjnego

i analiza wygaszania fluorescencji

i analiza wygaszania fluorescencji

3.

3.

Technika obrazów fluorescencyjnych

Technika obrazów fluorescencyjnych

4.

4.

Możliwości wykorzystania technik

Możliwości wykorzystania technik

fluorescencyjnych

fluorescencyjnych

5.

5.

Podsumowanie

Podsumowanie

Zjawisko fluorescencji

Zjawisko fluorescencji

Fluorescencja jest jednym z rodzajów

Fluorescencja jest jednym z rodzajów

luminescencji. Luminescencja to najkrócej ujmując

luminescencji. Luminescencja to najkrócej ujmując

emisja światła przez cząsteczki. Zjawisko

emisja światła przez cząsteczki. Zjawisko

fluorescencji polega na emisji kwantów światła z

fluorescencji polega na emisji kwantów światła z

singletowych stanów wzbudzonych cząsteczek.

singletowych stanów wzbudzonych cząsteczek.

Wzbudzenie to następuje zazwyczaj pod wpływem

Wzbudzenie to następuje zazwyczaj pod wpływem

promieniowania elektomagnetycznego (UV, światło

promieniowania elektomagnetycznego (UV, światło

widzialne), lecz możliwe jest też wzbudzenie

widzialne), lecz możliwe jest też wzbudzenie

cząsteczek za pomocą promieniowania

cząsteczek za pomocą promieniowania

jonizującego, prądem elektrycznym czy też

jonizującego, prądem elektrycznym czy też

czynnikami mechanicznymi. Fluorescencja może

czynnikami mechanicznymi. Fluorescencja może

być także wywołana reakcjami chemicznymi czy

być także wywołana reakcjami chemicznymi czy

enzymatycznymi.

enzymatycznymi.

Zjawisko fluorescencji

Zjawisko fluorescencji

Diagram Jabłońskiego stanowi uproszczony układ kilku najniższych stanów

Diagram Jabłońskiego stanowi uproszczony układ kilku najniższych stanów

elektronowych oraz oscylacyjnych jakie może osiągnąć cząsteczka. Obecność

elektronowych oraz oscylacyjnych jakie może osiągnąć cząsteczka. Obecność

stanów singletowych (S0, S1, S2) i trypletowych (T1) spowodowana jest tym, że

stanów singletowych (S0, S1, S2) i trypletowych (T1) spowodowana jest tym, że

spiny elektronów decydujących o właściwościach optycznych mogą być

spiny elektronów decydujących o właściwościach optycznych mogą być

ustawione równolegle lub antyrównolegle. W stanie singletowym spiny

ustawione równolegle lub antyrównolegle. W stanie singletowym spiny

elektronów ustawione są antyrównolegle, natomiast w stanie trypletowym

elektronów ustawione są antyrównolegle, natomiast w stanie trypletowym

równolegle. Przejścia singlet-tryplet, czyli przejścia z odwróceniem spinu, są

równolegle. Przejścia singlet-tryplet, czyli przejścia z odwróceniem spinu, są

zabronione. Jednak obecność ciężkich atomów, może umożliwić bezpromieniste

zabronione. Jednak obecność ciężkich atomów, może umożliwić bezpromieniste

przejście cząsteczki z wzbudzonego stanu singletowego do stanów trypletowych.

przejście cząsteczki z wzbudzonego stanu singletowego do stanów trypletowych.

Pomimo małej odległości stanów S

Pomimo małej odległości stanów S

1

1

i T

i T

1

1

proces ten jest jednak bardzo wolny, gdyż

proces ten jest jednak bardzo wolny, gdyż

towarzyszy mu zabronione odwrócenie spinu elektronu. Stała szybkości tego

towarzyszy mu zabronione odwrócenie spinu elektronu. Stała szybkości tego

przejścia (kst) może wynosić od 10

przejścia (kst) może wynosić od 10

6

6

-10

-10

10

10

s

s

-1

-1

. Cząsteczka znajdująca się w stanie

. Cząsteczka znajdująca się w stanie

trypletowym T

trypletowym T

1

1

może przejść do stanu podstawowego S

może przejść do stanu podstawowego S

0

0

z udziałem emisji

z udziałem emisji

fosforescencji (strzałki ciągłe) lub bezpromieniście (strzałka przerywana).

fosforescencji (strzałki ciągłe) lub bezpromieniście (strzałka przerywana).

Zjawisko fluorescencji

Zjawisko fluorescencji

Przy danej konfiguracji elektronowej cząsteczka może znajdować się w różnych

Przy danej konfiguracji elektronowej cząsteczka może znajdować się w różnych

stanach oscylacyjnych. W temperaturze pokojowej, w warunkach równowagi

stanach oscylacyjnych. W temperaturze pokojowej, w warunkach równowagi

termodynamicznej większość cząsteczek zajmuje najniższy poziom oscylacyjny

termodynamicznej większość cząsteczek zajmuje najniższy poziom oscylacyjny

stanu podstawowego S

stanu podstawowego S

0

0

. Są one w stanie zaabsorbować w czasie około 10

. Są one w stanie zaabsorbować w czasie około 10

-15

-15

s

s

kwant promieniowania (hν) i przejść do wzbudzonego stanu oscylacyjnego

kwant promieniowania (hν) i przejść do wzbudzonego stanu oscylacyjnego

jednego z wyższych stanów elektronowych (S

jednego z wyższych stanów elektronowych (S

1

1

lub S

lub S

2

2

). Cząsteczka bardzo szybko

). Cząsteczka bardzo szybko

traci nadmiar energii (10

traci nadmiar energii (10

-11

-11

– 10

– 10

-12

-12

s) i przechodzi do najniższego stanu

s) i przechodzi do najniższego stanu

oscylacyjnego elektronowego stanu S

oscylacyjnego elektronowego stanu S

1

1

. Na tym poziomie przebywa ok. 10

. Na tym poziomie przebywa ok. 10

-8

-8

s i

s i

stąd rozpoczyna się proces promienisty czyli emisja fluorescencji przy powrocie z

stąd rozpoczyna się proces promienisty czyli emisja fluorescencji przy powrocie z

poziomu S

poziomu S

1

1

do stanu podstawowego S

do stanu podstawowego S

0

0

(strzałki ciągłe). Molekuła znajdująca się

(strzałki ciągłe). Molekuła znajdująca się

we wzbudzonym stanie singletowym (S

we wzbudzonym stanie singletowym (S

1

1

, S

, S

2

2

) może przejść do stanu

) może przejść do stanu

podstawowego również na drodze bezpromienistej przemiany (strzałki

podstawowego również na drodze bezpromienistej przemiany (strzałki

przerywane). Emisji fluorescencji towarzyszy wcześniejsza emisja ciepła, stąd

przerywane). Emisji fluorescencji towarzyszy wcześniejsza emisja ciepła, stąd

emitowany kwant ma mniejszą energię niż promieniowanie pochłonięte.

emitowany kwant ma mniejszą energię niż promieniowanie pochłonięte.

Widmo fluorescencji liścia

Widmo fluorescencji liścia

Wg. Buschmann i wsp. Photosynthetica 38: 483-491 (2000)

Wg. Buschmann i wsp. Photosynthetica 38: 483-491 (2000)

Energia świetlna jest absorbowana przez chlorofil
znajdujący się w tkankach roślinnych i używana
jako „siła napędowa” dla procesów
fotochemicznych fotosyntezy. Staje się ona
wówczas energią chemiczną, która może być
wykorzystywana przez rośliny. Chlorofil absorbuje
światło w zakresie długości fal 400 - 700nm
(promieniowanie fotosyntetycznie czynne, PAR).

Wydajność procesów fotochemicznych jest ograniczona i zależy od
wielu czynników, w

tym

działania niekorzystnych czynników

środowiska. Nadmiar energii w stosunku do możliwości jej
wykorzystania w procesach fotochemicznych musi być efektywnie
rozpraszany. Rozpraszanie obejmuje zarówno emisję ciepła, jak i
reemisję słabych, ale mierzalnych ilości promieniowania o wyższej
od promieniowania wzbudzającego długości fali (czerwonego i
dalekiej czerwieni). Emisja fluorescencji z liści jest zbyt słaba,
żeby można było ją zobaczyć gołym okiem. Maksimum emisji
przypada na zakres czerwony

(» 685nm) i emisja stopniowo spada

w zakresie dalekiej czerwieni i bliskiej podczerwieni (do około
800nm).

Wymienione procesy konkurują ze sobą o
ograniczoną pulę zaabsorbowanej energii,
stąd każda zmiana w wykorzystaniu energii
w którymkolwiek z procesów powoduje
odpowiednie zmiany w wydajności innych.
Sprawia to, że pomiar fluorescencji chlorofilu
może zostać użyty jako szybka, obiektywna i
nieinwazyjna metoda badania procesów
fotochemicznych fotosyntezy.
Procesy te zachodzą w dwóch różnych
układach białkowo-barwnikowych znanych
jako fotosystem I (PSI) i fotosystem II (PSII).
W fizjologicznym zakresie temperatur około
95% sygnału fluorescencji chlorofilu
pochodzi z cząsteczek chlorofilu związanych
z PSII.

Pomiary kinetyki indukcji

Pomiary kinetyki indukcji

fluorescencji po oświetleniu

fluorescencji po oświetleniu

światłem wysycającym

światłem wysycającym

Fluorymetr Handy-PEA firmy Hansatech-Instruments Ltd.
Zdjęcie – Hansatech-Instruments Ltd.

Faza jasna fotosyntezy

Faza jasna fotosyntezy

Zmiana sygnału fluorescencyjnego po

Zmiana sygnału fluorescencyjnego po

oświetleniu liścia zaadaptowanego do

oświetleniu liścia zaadaptowanego do

ciemności (fotosynteza nie zachodzi) –

ciemności (fotosynteza nie zachodzi) –

Krzywa Kautzkiego

Krzywa Kautzkiego

Dane te dostarczają informacji

Dane te dostarczają informacji

o:

o:



maksymalnej wydajności kwantowej

maksymalnej wydajności kwantowej

PSII: F

PSII: F

v

v

/F

/F

m

m

(F

(F

v

v

= F

= F

m

m

– F

– F

0

0

)

)

W przypadku stosowania czulszej

W przypadku stosowania czulszej

aparatury wykonać można

aparatury wykonać można

dokładniejszą analizę, np. JIP – test

dokładniejszą analizę, np. JIP – test

(Strasser i wsp. 1998). Podobne

(Strasser i wsp. 1998). Podobne

pomiary wykonać można tu zarówno

pomiary wykonać można tu zarówno

na liściach zaadaptowanych do

na liściach zaadaptowanych do

ciemności, jak i oświetlanych przed

ciemności, jak i oświetlanych przed

pomiarem.

pomiarem.

16

16

PRZEBIEG POMIARU

PRZEBIEG POMIARU



Badany fragment liścia jest zacieniamy przez

Badany fragment liścia jest zacieniamy przez

15 minut przy pomocy klipsa celem

15 minut przy pomocy klipsa celem

zahamowania procesu fotosyntezy.

zahamowania procesu fotosyntezy.



Klips nakłada się na głowicę oświetlającą liść.

Klips nakłada się na głowicę oświetlającą liść.



Uruchamia się program pomiarowy.

Uruchamia się program pomiarowy.

•

W programie ustala się czas (>0,3 s) i natężenie

W programie ustala się czas (>0,3 s) i natężenie

oświetlenia wzbudzającego chlorofil ‘a’ >2000 µmol

oświetlenia wzbudzającego chlorofil ‘a’ >2000 µmol

[hν] · m

[hν] · m

-2

-2

·s

·s

-1

-1

.

.

•

Matryca diod LED emituje promieniowanie z

Matryca diod LED emituje promieniowanie z

maksimum przy 650 nm,

maksimum przy 650 nm,

•

Natężenie fluorescencji chlorofilu ‘a’ po przejściu

Natężenie fluorescencji chlorofilu ‘a’ po przejściu

poprzez filtr Knoppa RG9 krótkofalowego

poprzez filtr Knoppa RG9 krótkofalowego

promieniowania niezwiązanego z fluorescencją

promieniowania niezwiązanego z fluorescencją

chlorofilu (<700 nm) mierzone jest przy pomocy

chlorofilu (<700 nm) mierzone jest przy pomocy

fotodiody PIN.

fotodiody PIN.

Fig. 1. Typowy przebieg krzywej indukcji fluorescencji (dane z przyrządu)

Wybrane parametry testu JIP

Wybrane parametry testu JIP

przepływy

strumieni

energii

ilorazy

strumieni

energii

• ABS/RC, ABS/CS

• ET/RC, ET/CS

• TR/RC, TR/CS

• DI/RC, DI/CS

• φ

Po

= TR/ABS

• ψ

o

= ET/TR

• φ

Eo

= ET / ABS

• RC/CS

•
RC/ABS

•SFI

(structure-function

indexes)

•PI (performance index)

•DF (driving-forces)

•OEC (O

2

evolving centers)

•N

•Sm

•Sm/t

Fmax

•k

p,

k

N

zagęszczen

ie

aktywnych

RC

wskaźniki

witalności

PSII

Obliczanie parametrów JIP-

Obliczanie parametrów JIP-

test

test

(Strasser

(Strasser

i wsp

i wsp

. 2000)

. 2000)

Liście zaadaptowane do ciemności wykazują po naświetleniu szybki wzrost intensywności

Liście zaadaptowane do ciemności wykazują po naświetleniu szybki wzrost intensywności

fluorescencji od początkowej

fluorescencji od początkowej

F

F

0

0

do maksymalnej

do maksymalnej

F

F

P

P

.

.

Intensywność tej ostatniej zależy od

Intensywność tej ostatniej zależy od

intensywności oświetlenia i jest najwyższa po przekroczeniu intensywności wysycającej

intensywności oświetlenia i jest najwyższa po przekroczeniu intensywności wysycającej

fotosyntezę, oznacza się ją wtedy

fotosyntezę, oznacza się ją wtedy

F

F

m

m

.

.

Pomiędzy tymi punktami intensywność fluorescencji

Pomiędzy tymi punktami intensywność fluorescencji

wykazuje też pośrednie maksima:

wykazuje też pośrednie maksima:

F

F

J

J

po około

po około

2 ms

2 ms

i

i

F

F

I

I

po

po

około

około

30 ms,

30 ms,

podczas gdy F

podczas gdy F

m

m

osiągane

osiągane

jest zwykle po czasie dłuższym od 300 ms

jest zwykle po czasie dłuższym od 300 ms

(Neubauer

(Neubauer

i

i

Schreiber, 1987, Strasser

Schreiber, 1987, Strasser

i wsp.

i wsp.

, 1995).

, 1995).

Używany tu fluorymetr

Używany tu fluorymetr

(Handy PEA,

(Handy PEA,

Hansatech Ltd. Kings Lynn, UK)

Hansatech Ltd. Kings Lynn, UK)

wykonuje pomiary

wykonuje pomiary

intensywności fluorescencji z dużą rozdzielczością czasową

intensywności fluorescencji z dużą rozdzielczością czasową

(10µs),

(10µs),

co umożliwia dokładną analizę

co umożliwia dokładną analizę

krzywej narastania sygnału fluorescencji

krzywej narastania sygnału fluorescencji

.

.

Fluorymetr mierzy:

Fluorymetr mierzy:

intensywność fluorescencji (F) po

intensywność fluorescencji (F) po

50

50

μ

μ

s, 100

s, 100

μ

μ

s, 300

s, 300

μ

μ

s, 2ms (F

s, 2ms (F

J

J

), 30ms (F

), 30ms (F

I

I

)

)

i maksymalny sygnał

i maksymalny sygnał

F

F

m

m

,

,

a ponadto

a ponadto

t

t

Fm

Fm

–

–

czas potrzebny

czas potrzebny

do osiągnięcia

do osiągnięcia

F

F

m

m

i

i

Area –

Area –

powierzchnię ponad krzywą indukcji od

powierzchnię ponad krzywą indukcji od

F

F

0

0

d

d

o F

o F

m

m

która jest

która jest

proporcjonalna do puli akceptorów elektronów po redukującej stronie PSII

proporcjonalna do puli akceptorów elektronów po redukującej stronie PSII

(Q

(Q

A

A

i ostatecznie

i ostatecznie

plastochinonu)

plastochinonu)

(Strasser

(Strasser

i

i

Strasser 1995) were recorded.

Strasser 1995) were recorded.

F

F

0

0

–

–

fluorescencja początkowa

fluorescencja początkowa

(minimalna) jest wyliczana przez wewnętrzne oprogramowanie

(minimalna) jest wyliczana przez wewnętrzne oprogramowanie

HandyPEA

HandyPEA

jako interpolacja

jako interpolacja

krzywej indukcji do czasu 0

krzywej indukcji do czasu 0

(Strasser

(Strasser

i

i

Strasser 1995).

Strasser 1995).

Dalsze parametry są wyliczane a

Dalsze parametry są wyliczane a

podstawie teorii przepływów energii w PSII

podstawie teorii przepływów energii w PSII

(Strasser

(Strasser

i

i

Tsimilli–Michael 2001)

Tsimilli–Michael 2001)

. Pomiary te, jak i

. Pomiary te, jak i

wyliczenia można wykonywać też na liściach oświetlanych przed pomiarem, wówczas w

wyliczenia można wykonywać też na liściach oświetlanych przed pomiarem, wówczas w

symbolach parametrów (

symbolach parametrów (

TR

TR

0

0

/CS, ET

/CS, ET

0

0

/CS, DI

/CS, DI

0

0

/CS, M

/CS, M

0

0

)

)

nie ma subskryptu 0, a

nie ma subskryptu 0, a

F

F

0

0

and F

and F

m

m

odnoszą się

odnoszą się

do minimalnej i maksymalnej fluorescencji na liściach preiluminowanych.

do minimalnej i maksymalnej fluorescencji na liściach preiluminowanych.

Pierwsza grupa parametrów reprezentuje tzw. fenomenologiczne przepływy energii:

Pierwsza grupa parametrów reprezentuje tzw. fenomenologiczne przepływy energii:

absorb

absorb

owanej

owanej

(ABS/CS),

(ABS/CS),

pułapkowanej w centrach reakcji PSII (

pułapkowanej w centrach reakcji PSII (

TR

TR

0

0

/CS),

/CS),

napędzającej transport

napędzającej transport

elektronów

elektronów

(ET

(ET

0

0

/CS)

/CS)

i rozpraszanej

i rozpraszanej

(DI

(DI

0

0

/CS),

/CS),

gdzie CS oznacza wzbudzony fragment przekroju

gdzie CS oznacza wzbudzony fragment przekroju

liścia liścia (z ang. cross-section)

liścia liścia (z ang. cross-section)

.

.



Wartość początkowej fluorescencji w liściach zaadaptowanych do ciemności

Wartość początkowej fluorescencji w liściach zaadaptowanych do ciemności

(F

(F

0

0

)

)

jest

jest

proponowana jako miara (w jednostkach arbitralnych) fenomenologicznego przepływu energii

proponowana jako miara (w jednostkach arbitralnych) fenomenologicznego przepływu energii

absorbowanej

absorbowanej

ABS/CS (Strasser

ABS/CS (Strasser

i

i

Strasser, 1995)

Strasser, 1995)

i jest używane w kalkulacjach dla próbek

i jest używane w kalkulacjach dla próbek

zacienianych i wcześniej oświetlanych

zacienianych i wcześniej oświetlanych

.

.



TR

TR

0

0

/CS = (F

/CS = (F

v

v

/F

/F

m

m

) ABS/CS

) ABS/CS



ET

ET

0

0

/CS = (F

/CS = (F

v

v

/F

/F

m

m

) [1–( F

) [1–( F

J

J

– F

– F

0

0

)/( F

)/( F

m

m

– F

– F

0

0

)]

)]

ABS/CS

ABS/CS



DI

DI

0

0

/CS = ABS/CS – TR

/CS = ABS/CS – TR

0

0

/CS

/CS



Możliwe jest też wyliczenie analogicznych

Możliwe jest też wyliczenie analogicznych

przepływów dla jednego, aktywnego

przepływów dla jednego, aktywnego

centrum reakcji (RC) – tu wyliczenia

centrum reakcji (RC) – tu wyliczenia

pominę

pominę



Dalsze parametry kalkulowane w JIP teście

Dalsze parametry kalkulowane w JIP teście

używają

używają

M

M

0

0

– znormalizowanej wartości

– znormalizowanej wartości

początkowego wzrostu fluorescencji

początkowego wzrostu fluorescencji

zmiennej

zmiennej

(M

(M

0

0

= dV/dt).

= dV/dt).

Fluorescencja

Fluorescencja

zmienna

zmienna

V = (F–F

V = (F–F

0

0

)/ (F

)/ (F

m

m

–F

–F

0

0

),

),

gdzie

gdzie

F –

F –

aktualna intensywność fluorescencji w

aktualna intensywność fluorescencji w

danym czasie

danym czasie

.

.

Po przekształceniach można

Po przekształceniach można

M

M

0

0

wyliczyć ze wzoru

wyliczyć ze wzoru

4 (F

4 (F

300µs

300µs

– F

– F

50µs

50µs

 )/(F

 )/(F

m

m

–

–

F

F

50µs

50µs

) (Tsimilli–Michael

) (Tsimilli–Michael

i

i

wsp

wsp

.

.

2000).

2000).



RC/CS

RC/CS

0

0

(

(

minimalna ilość aktywnych centrów

minimalna ilość aktywnych centrów

reakcji we wzbudzonym przekroju liścia)

reakcji we wzbudzonym przekroju liścia)

:

:

RC/CS

RC/CS

0

0

= [(ABS/CS)/(F

= [(ABS/CS)/(F

v

v

/F

/F

m

m

)]/{M

)]/{M

0

0

/[(F

/[(F

J

J

–F

–F

0

0

)/(F

)/(F

m

m

–F

–F

0

0

)]}

)]}



Dla wyliczenia ilości maksymalnej (RC/CS

Dla wyliczenia ilości maksymalnej (RC/CS

m

m

) w

) w

miejsce ABS/CS używa się

miejsce ABS/CS używa się

F

F

m

m

.

.



Wyliczyć można też ogólny indeks sprawności

Wyliczyć można też ogólny indeks sprawności

transferu energii (PI), dla przykładu, jeśli za

transferu energii (PI), dla przykładu, jeśli za

punkt wyjścia przyjmiemy jednakową absorpcję

punkt wyjścia przyjmiemy jednakową absorpcję

oznaczony jako

oznaczony jako

PI

PI

ABS

ABS

(Strasser

(Strasser

i

i

Tsimilli–Michael

Tsimilli–Michael

2001). PI

2001). PI

ABS

ABS

= {[(TR

= {[(TR

0

0

/ABS)/[1–(TR

/ABS)/[1–(TR

0

0

/ABS)]}

/ABS)]}

{[( ET

{[( ET

0

0

/TR

/TR

0

0

)/[1–( ET

)/[1–( ET

0

0

/TR

/TR

0

0

)]} [1/(ABS/RC)],

)]} [1/(ABS/RC)],

gdzie

gdzie

:

:



TR

TR

0

0

/ABS = Fv/Fm

/ABS = Fv/Fm



ET

ET

0

0

/TR

/TR

0

0

= 1–[(F

= 1–[(F

J

J

–F

–F

0

0

)/(F

)/(F

m

m

–F

–F

0

0

)]

)]



ABS/RC = M

ABS/RC = M

0

0

{1/[(F

{1/[(F

J

J

–F

–F

0

0

)/(F

)/(F

m

m

–F

–F

0

0

)]} (F

)]} (F

m

m

/F

/F

v

v

)

)

18

18

PARAMETRY

PARAMETRY

ETo/RC

ABS/RC

DIo/RC

TRo/RC

PI abs = 38,0717

1

biol-1

RC Scale: 4

19

19

PARAMETRY

PARAMETRY

ETo/CSm

DIo/CSm

TRo/CSm

ABS/CSm

biol-1

1

LM Scale: 2980

Pomiary modulowanego

Pomiary modulowanego

sygnału

sygnału

fluorescencyjnego

fluorescencyjnego

Fluorymetr FMS2 firmy Hansatech-Instruments Ltd.
Zdjęcie – Hansatech-Instruments Ltd.



Metoda umożliwia pomiary na świetle

Metoda umożliwia pomiary na świetle



Największą przewagą fluorescencji modulowanej

Największą przewagą fluorescencji modulowanej

w porównaniu do metody poprzedniej jest

w porównaniu do metody poprzedniej jest

możliwość pomiaru stopnia utlenienia PSII

możliwość pomiaru stopnia utlenienia PSII



Problemem w tym przypadku staje się

Problemem w tym przypadku staje się

rozróżnienie światła oświetlającego próbkę o

rozróżnienie światła oświetlającego próbkę o

długości odpowiadającej maksimum fluorescencji

długości odpowiadającej maksimum fluorescencji

od samej fluorescencji

od samej fluorescencji



Liść oświetla się dodatkowo wiązką światła o

Liść oświetla się dodatkowo wiązką światła o

modulowanej częstotliwości (

modulowanej częstotliwości (

1.8 µs

1.8 µs

),

),

dostarczającej sumarycznie bardzo niewielkiej

dostarczającej sumarycznie bardzo niewielkiej

ilości światła (<0.05 µmol m

ilości światła (<0.05 µmol m

-2

-2

s

s

-1

-1

), która nie może

), która nie może

spowodować zmian w aparacie fotosyntetycznym

spowodować zmian w aparacie fotosyntetycznym



Światło którym oświetlony jest liść podnosi

Światło którym oświetlony jest liść podnosi

poziom sygnału modulacji

poziom sygnału modulacji



Ponieważ intensywność światła odbieranego jako

Ponieważ intensywność światła odbieranego jako

sygnał fluorescencyjny wywoływanego przez

sygnał fluorescencyjny wywoływanego przez

wiązkę modulowaną jest stała układ elektroniczny

wiązkę modulowaną jest stała układ elektroniczny

może ten wzrost intensywności obliczyć (jest to

może ten wzrost intensywności obliczyć (jest to

właściwy sygnał fluorescencyjny)

właściwy sygnał fluorescencyjny)

Typowy przebieg pomiaru fluorescencji

Typowy przebieg pomiaru fluorescencji

chlorofilu z wykorzystaniem metody

chlorofilu z wykorzystaniem metody

impulsowej

impulsowej

SL – światło wysycające
AL – światło aktyniczne (ciągłe)
FR – światło dalekiej czerwieni (wzbudzające selektywnie PSI)

Wyliczane parametry:

Wyliczane parametry:



maksymalna wydajność kwantowa PSII

maksymalna wydajność kwantowa PSII

(F

(F

v

v

/F

/F

M

M

) – jak w poprzedniej metodzie

) – jak w poprzedniej metodzie



aktualna wydajność kwantowa PSII

aktualna wydajność kwantowa PSII





PSII = (F’

PSII = (F’

M

M

– F

– F

S

S

)/F’

)/F’

M

M



Szybkość transportu elektronów

Szybkość transportu elektronów

ETR = PAR

ETR = PAR

·

·

0.82

0.82

·

·

2

2

·

·





PSII

PSII



wydajność pułapkowania światła przez

wydajność pułapkowania światła przez

anteny PSII (F’

anteny PSII (F’

V

V

/F’

/F’

M

M

)

)



współczynniki wygaszania fluorescencji

współczynniki wygaszania fluorescencji

Wyznaczanie współczynników

Wyznaczanie współczynników

wygaszania fluorescencji chlorofilu

wygaszania fluorescencji chlorofilu

qP – współczynnik fotochemicznego wygaszania fluorescencji

qP – współczynnik fotochemicznego wygaszania fluorescencji

NPQ – współczynnik niefotochemicznego wygaszania fluorescencji:

NPQ – współczynnik niefotochemicznego wygaszania fluorescencji:

qE – wygaszanie związane z transtylakoidalnym gradientem protonów

qE – wygaszanie związane z transtylakoidalnym gradientem protonów

qT – wygaszanie związane z rozsprzęganiem systemów antenowych i

qT – wygaszanie związane z rozsprzęganiem systemów antenowych i

centrów reakcji PSII

centrów reakcji PSII

qI – wygaszanie fotoinhibitorowe (związane z cyklem ksantofilowym)

qI – wygaszanie fotoinhibitorowe (związane z cyklem ksantofilowym)

Współczynniki wygaszania

Współczynniki wygaszania

fluorescencji chlorofilu

fluorescencji chlorofilu

q

q

P

P

– Współczynnik fotochemicznmego

– Współczynnik fotochemicznmego

wygaszania fluorescencji informujący o

wygaszania fluorescencji informujący o

ilości energii napędzającej transport

ilości energii napędzającej transport

elektronów w tylakoidach (procesy

elektronów w tylakoidach (procesy

fotochemiczne), czyli o względnym

fotochemiczne), czyli o względnym

stopniu utlenienia Q

stopniu utlenienia Q

A

A

:

:

q

q

P

P

= (F’

= (F’

M

M

-F

-F

s

s

)/(F’

)/(F’

M

M

-F’

-F’

0

0

)

)

NPQ – Współczynnik

NPQ – Współczynnik

niefotochemicznego wygaszania

niefotochemicznego wygaszania

fluorescencji informujący o ilości

fluorescencji informujący o ilości

energii rozpraszanej w postaci ciepła:

energii rozpraszanej w postaci ciepła:

NPQ = (F

NPQ = (F

M

M

-F’

-F’

M

M

)/F

)/F

M

M

’

’

Technika obrazów

Technika obrazów

fluorescencyjnych

fluorescencyjnych

Fluorymetr IMAGING PAM firmy Heinz WALZ GmBH,
Zdjęcie Heinz WALZ GmBH

Jest ona modyfikacją fluorescencji

Jest ona modyfikacją fluorescencji

impulsowej umożliwiającą śledzenie

impulsowej umożliwiającą śledzenie

procesów zachodzących w całych

procesów zachodzących w całych

liściach, czy roślinach.

liściach, czy roślinach.

Typowo otrzymuje się

Typowo otrzymuje się

dwuwymiarowe mapy:

dwuwymiarowe mapy:

F

F

0

0

, F

, F

M

M

, F

, F

V

V

,

,

F

F

V

V

/F

/F

M

M

,

,

F

F

’

’

V

V

/F

/F

’

’

M

M

,

,





PSII czy

PSII czy

NPQ

NPQ

Zalety i wady metody

Zalety i wady metody

obrazowania

obrazowania



Bardzo duża dokładność i powtarzalność

Bardzo duża dokładność i powtarzalność

wyników

wyników

– pomiar na dużej powierzchni jest

– pomiar na dużej powierzchni jest

ważniejszy nawet od błędów wynikających z

ważniejszy nawet od błędów wynikających z

nierównomiernego oświetlenia czy kątowego

nierównomiernego oświetlenia czy kątowego

odbijania/rozpraszania światła.

odbijania/rozpraszania światła.



Trzeba bardzo starannie ustawiać przyrząd

Trzeba bardzo starannie ustawiać przyrząd

,

,

powtarzalności pomiaru nie może zapewnić

powtarzalności pomiaru nie może zapewnić

układ elektroniczny.

układ elektroniczny.



Ciężko zastosować wysokie natężenia

Ciężko zastosować wysokie natężenia

światła aktynicznego

światła aktynicznego

(zbyt duży wzrost

(zbyt duży wzrost

temperatury, nierównomierność oświetlania)

temperatury, nierównomierność oświetlania)

Inne możliwości

Inne możliwości

pomiarów fluorescencji

pomiarów fluorescencji

chlorofilu

chlorofilu

Obrazy fluorescencyjne mogą być

Obrazy fluorescencyjne mogą być

zbierane z pokładu samolotów, czy

zbierane z pokładu samolotów, czy

satelitów (przy bezchmurnym

satelitów (przy bezchmurnym

niebie) dla diagnozowania stanu

niebie) dla diagnozowania stanu

upraw. Obecnie technika ta

upraw. Obecnie technika ta

umożliwia jedynie pomiary F

umożliwia jedynie pomiary F

s

s

, ale

, ale

w przyszłości możliwy stanie się

w przyszłości możliwy stanie się

zapewne pomiar innych

zapewne pomiar innych

parametrów z wykorzystaniem

parametrów z wykorzystaniem

laserów wzbudzających

laserów wzbudzających

fluorescencję.

fluorescencję.

Możliwości zastosowań

Możliwości zastosowań

pomiarów fluorescencji

pomiarów fluorescencji

chlorofilu:

chlorofilu:



Fizjologia roślin – pomiary i demonstracje

Fizjologia roślin – pomiary i demonstracje

w badaniach mechanizmu fotosyntezy

w badaniach mechanizmu fotosyntezy

i w dydaktyce.

i w dydaktyce.



Hodowla roślin i produkcja roślin w

Hodowla roślin i produkcja roślin w

warunkach kontrolowanych – optymalizacja

warunkach kontrolowanych – optymalizacja

warunków fotosyntezy, unikanie warunków

warunków fotosyntezy, unikanie warunków

stresowych, selekcja roślin

stresowych, selekcja roślin

transgenicznych, selekcja roślin odpornych

transgenicznych, selekcja roślin odpornych

na niekorzystne czynniki środowiska.

na niekorzystne czynniki środowiska.

Możliwości zastosowań

Możliwości zastosowań

pomiarów fluorescencji

pomiarów fluorescencji

chlorofilu:

chlorofilu:



Produkcja roślinna – wczesne

Produkcja roślinna – wczesne

wykrywanie stresów środowiskowych

wykrywanie stresów środowiskowych

i deficytu składników mineralnych,

i deficytu składników mineralnych,

określanie wpływu warunków uprawy

określanie wpływu warunków uprawy

czy systemów produkcji na fotosyntezę.

czy systemów produkcji na fotosyntezę.



Badania agrochemikaliów – określanie

Badania agrochemikaliów – określanie

wpływu na fotosyntezę, badania

wpływu na fotosyntezę, badania

skuteczności działania herbicydów oraz

skuteczności działania herbicydów oraz

tolerancji na ich stosowanie.

tolerancji na ich stosowanie.

Możliwości zastosowań

Możliwości zastosowań

pomiarów fluorescencji

pomiarów fluorescencji

chlorofilu:

chlorofilu:



Badania zanieczyszczeń

Badania zanieczyszczeń

środowiskowych – wpływ ozonu,

środowiskowych – wpływ ozonu,

tlenków azotu, tlenków siarki i innych

tlenków azotu, tlenków siarki i innych

zmian środowiskowych na rośliny.

zmian środowiskowych na rośliny.



Leśnictwo – badania zamierania lasów

Leśnictwo – badania zamierania lasów

i zanieczyszczeń środowiskowych,

i zanieczyszczeń środowiskowych,

określanie starzenia się drzew.

określanie starzenia się drzew.

Możliwości zastosowań

Możliwości zastosowań

pomiarów fluorescencji

pomiarów fluorescencji

chlorofilu:

chlorofilu:



Ekologia – badania tolerancji na

Ekologia – badania tolerancji na

stresy

stresy

i aklimacji. Badania zjawiska

i aklimacji. Badania zjawiska

allelopatii.

allelopatii.



Testowanie świeżości produktów

Testowanie świeżości produktów

pochodzenia roślinnego (warzywa,

pochodzenia roślinnego (warzywa,

kwiaty, owoce), np. w celu

kwiaty, owoce), np. w celu

optymalizacji terminu ich sprzedaży.

optymalizacji terminu ich sprzedaży.

Podsumowanie

Podsumowanie

Fluorescencja chlorofilu jest techniką

Fluorescencja chlorofilu jest techniką

niezastąpioną w badaniach aparatu

niezastąpioną w badaniach aparatu

fotosyntetycznego roślin.

fotosyntetycznego roślin.

Wydaje się też być najbardziej

Wydaje się też być najbardziej

uniwersalną i bardzo prostą metodą

uniwersalną i bardzo prostą metodą

diagnozowania stanu roślin („roślinne

diagnozowania stanu roślin („roślinne

EKG”).

EKG”).

Podsumowanie

Podsumowanie

Jednak każde konkretne wdrożenie metody

Jednak każde konkretne wdrożenie metody

poprzedzone być powinno wnikliwymi fizjologicznymi

poprzedzone być powinno wnikliwymi fizjologicznymi

badaniami zależności pomiędzy pracą aparatu

badaniami zależności pomiędzy pracą aparatu

fotosyntetycznego, a danym czynnikiem (dobór

fotosyntetycznego, a danym czynnikiem (dobór

metod i warunków pomiarów, parametrów i t.d.).

metod i warunków pomiarów, parametrów i t.d.).

Dla przykładu spadek maksymalnej wydajności

Dla przykładu spadek maksymalnej wydajności

kwantowej PSII kojarzony zwykle z negatywnym

kwantowej PSII kojarzony zwykle z negatywnym

wpływem czynnika zewnętrznego może być w

wpływem czynnika zewnętrznego może być w

niektórych przypadkach (np. w badaniach

niektórych przypadkach (np. w badaniach

zimotrwałości niektórych gatunków roślin) przejawem

zimotrwałości niektórych gatunków roślin) przejawem

zwiększonej odporności na ten czynnik, a nie

zwiększonej odporności na ten czynnik, a nie

sygnałem uszkodzeń.

sygnałem uszkodzeń.