2. Technika PCR

Skład mieszaniny:

- bufor reakcyjny ( zawierający min. MgCl2 )
- mieszanina primerów
- trójfosforany dNTP
(adeniny, cytozyny, guaniny i tyminy)
- termostabilna polimeraza DNA Taq
- (Thermophilus aquaticus)
- próbka matrycowego DNA

1

. Sekwencje cp DNA

•

rbcL

- gen o długości ~1500 bp

kodujący

•

dużą podjednostkę karboksylazy

•

rybulozo-1,5-bifosforanu (RUBISCO ),

•

takich jak rodzina, rząd czy klasa

•

kluczowego enzymu w fotosyntezie;

•

ze względu na pełnioną funkcję gen

•

ten jest niezwykle silnie
konserwowany

•

ewolucyjnie; używany jest w
filogenezie

•

na wyższych poziomach
taksonomicznych,

2. Sekwencje jądrowe

• nrDNA

- nrDNA stanowią duże rodzinę genów

•

jądrowych kodujących rybosomalne białka oraz

•

rRNA (budujące podjednostki rybosomu); najczęściej

•

używanym markerem nrDNA są regiony ITS

•

(Internal Transcribed Spacer, wewnętrzny

•

transkrybowany przerywnik); są to dwie sekwencje

•

niekodujące rozdzielające geny dla małej i dużej

•

podjednostki rybosomu; transkrypty ITS biorą udział

•

w dojrzewaniu rybosomu, nie są jednak włączane w

•

jego strukturę; brak znaczącej funkcjonalności

•

warunkuje szybkie tempo ewolucji tych sekwencji

•

przezco używane są one w filogenezie na niskich

•

poziomach taksonomicznych, takich jak rodzaj,

•

gatunek a nawet populacja.

ryc. jednostka rDNA

The molecular "Tree of Life" consists of three

domains derived from 16S rDNA genetic data. 16S

rDNA is the gene that codes for ribosomal RNA, a key

part of cellular reproduction. Eukarya includes plants,

animals, and fungi.

3. Sekwencje mtDNA

• geny mtDNA były dotychczas szerzej
• wykorzystywane w systematyce zwierząt,
• niemniej genom mitochondrialny roślin
• również zawiera sekwencje potencjalnie
• użyteczne w badaniach filogenetycznych;
• dwie dotychczas poznane to

coxl

i

atpA

• należące do genów konserwatywnych;
• ich bardzo wolne tempo ewolucji pozwala
• na wykorzystanie w badaniach na poziomach
• rodziny, rzędu czy klasy.

Palmer JD, Herbon LA.

J Mol Evol. 1988 Dec-1989 Feb;28(1-2):87-97.

Uproszczony schemat procesu badawczego z
zastosowaniem reakcji PCR



Dopasowanie – PAUP, Clustal X,
Seaview

A

naliza

filogenetyczna

W analizie filogenetycznej wykorzystuje się zestawienie

sekwencji dopasowanych (multiple sequence alignment).

Poszczególne pozycje dopasowania są określane jako

miejsca (site), które są odpowiednikiem cech, natomiast

zasada zajmująca dane miejsce jest zwana stanem cechy

(character state). Aby właściwie oszacować stopień

pokrewieństwa

należy

porównać

ze

sobą

cechy

homologiczne. W tym celu w procesie dopasowania

sekwencji wstawia się przerwy (gaps), które są

odpowiednikiem insercji lub delecji (tzw. indeli, indels).

Sekwencje DNA przed dopasowaniem (alignment)

Sekwencje DNA po dopasowaniu (alignment)

Analiza
Filogenetyczna



Model substytucji DNA –

Modeltest 3.7



Konstrukcja drzewa –

PAUP i

MrBayes



Metodę parsymonii



Największej wiarygodności



Analiza bayesowska



Metoda minimalnych odległości

Ryc. Sposób obrazowania powiązań filogenetycznych w
postaci niezakorzenionego drzewa reprezentowanego
przez pięć taksonów (A-E).

A

B

C

D

E

Gałąź

Węzeł wewnętrzny

Węzeł
zewnętrzny

Związki wynikające z analizy filogenetycznej są najczęściej

przedstawiane w postaci drzewa filogenetycznego składającego

z gałęzi, przedzielonych i zakończonych węzłami. Węzły na

szczytach gałęzi reprezentują analizowane taksony, natomiast

wewnętrzne węzły są miejscem rozwidlania gałęzi i odpowiadają

hipotetycznym przodkom. W przypadku molekularnej analizy

filogenetycznej węzły odpowiadają sekwencjom kwasów

nukleinowych lub białek.

Cyclopogon lindleyanus
Cyclopogon pamii
Cyclopogon

sp. 28 07

Eltroplectris 28 07
Pelexia nigrescens
Odontorrhynchus variabilis
Sauroglossum aurantiacum
Sarcoglottis neglecta
Sauroglossum elatum
Coccineorchis sp.
Mesadenella cuspidata
Eltroplectris roseoalba
Skeptrostachys sp.
Mesadenella 28.07
Stenorrhynchos speciosum
Burnsbaloghia diaphana
Stenorrhynchos aurantiacus
Schiedeella llaveana
Mesadenus lucayanus
Spiranthes cernua
Funkiella hyemalis
Lankesterella gnomus
Lankesterella sp.
Lankesterella orthantha
Eurystyles 8215
Eurystyles s.n.
Eurystyles sp.
Eurystyles cotyledon
Prescottia tubulosa
Coccineorchis sp.07
Cranichis ciliilabia
Altensteinia fimbriata
Manniella gustavi
Aspidogyne pumila
Pachyplectron arifolium
Pterostylis curta
Chloraea flavescens
Cynorkis grandiflora
Benthamia latifolia
Coleoglossum viride

2

6

20

6

3

9

1

5

1

2

14

4

3

17

7

1

5

1

14

8

7

10

13

3

19

3

2

3

3

2

4

0

9

7

6

13

5

2

2

3

5

3

10

10

18

21

18

28

12

2

0

14

33

2

3

0

1

2

3

32

9

22

31

15

18

39

18

50
42

25

8

33

46

7

20
27

19

Cyclopogoninae

Spiranthinae

Stenorrhynchidinae

Prescottinae

Manniellinae

Pachyplectroninae

Cranichideae

Goodyereae

Thelymitroideae

Orchidoideae

91

100

59

91

63

58

64

70

70

100

100

86

93

100

66

87

86

79

97

71

60

68

80

99

100

71

99

85

59

100

100

matK

OCENA WIARYGODNOŚCI DRZEWA

Ostatnim etapem każdej analizy jest ocena wiarygodności

otrzymanych

wyników,

która

jest

miarą

prawdopodobieństwa, że taksony danego kladu zawsze

do niego należą. Istnieje kilka metod oceniających

wiarygodność poszczególnych kladów na drzewie, jednak

najpowszechniej używane to testy oceniające drzewo na

podstawie

ponownie

pobieranych

próbek

z

obserwowanych danych (m.in. metoda nieparametryczna

bootstrap)

Drzewo gatunku a drzewo

genu

Incongruity of primate species tree and DQA1

promoter region gene tree.

Loisel D A et al. PNAS

2006;103:16331-16336

©2006 by National Academy of Sciences

AFLP

– AMPLIFIED FRAGMENTS OF

LENGTH POLYMORPHISM

Polimorfizm długości fragmentów

amplifikowanych

METODY OPARTE NA REAKCJI PCR

ANALIZA AFLP

(mikrosatelity lub SSR –
Simple Sequence Repeats)
sekwencje zawierające od
10 – 50 powtórzeń motywu o długości

do 6 par zasad. ...

Jednonukleotydowe SSR (A)8
AAAAAAAA

Dwunukleotydowe SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT

Trzynukleotydowe SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG

Tetranukleotydowe SSR (ACTC)4
ACTCACTCACTCACTC

–

Homozygotyczne

…

CGTAGCCTTGCATCCTT

CTCTCTCTCTCTCT

ATCGGTACTACGT

GG…
…

CGTAGCCTTGCATCCTT

CTCTCTCTCTCTCT

ATCGGTACTACGT

GG…

5’ flanking region microsatellite locus

3’ flanking region

–

Heterozygotyczne

…CGTAGCCTTGCATCCTT

CTCTCTCTCTCTCT

ATCGGTACTACGTGG…

…

CGTAGCCTTGCATCCTT

CTCTCTCTCTCTCTCTCT

ATCGGTACTACGTG

G…