W4 PCR, Sekwencjonowanie

background image

PCR,

Sekwencjonowa

nie

background image

Reakcja PCR

(Polymerase Chain Reaction)

Najczulsza

metoda

służąca

do

wykrywania
i powielania fragmentów DNA o
określonej sekwencji.
Pozwala na wykrycie i amplifikację
pojedynczej

kopii

interesującej

sekwencji
z preparatu DNA całkowitego.

background image

Składniki mieszaniny

reakcyjnej

Termostabilna polimeraza DNA
Para syntetycznych

oligonukleotydów jako startery
syntezy DNA

Trójfosforany deoksynukleotydów
Kationy dwuwartościowe (Mg

2+

)

Bufor o pH 8.3-8.8
Kationy jednowartościowe (K

+

)

Matryca DNA

background image

Polimeraza DNA

przyłącza

nukleotydy

do końca 3’ – tzn.

katalizuje

reakcję

wydłużania

w kierunku 5’→3’

background image

Główne etapy reakcji PCR:

Denaturacja wyjściowych cząsteczek
DNA
Wiązanie starterów (annealing)
Wydłużanie łańcucha (extension)

background image

Denaturacja

Denaturacja – rozdzielenie nici DNA pod wpływem

temperatury

Temperatura denaturacji zależy od składu zasad
fragmentu który chcemy powielić i odporności
polimerazy na wysoką temperaturę.
Najpopularniejsza polimeraza używana standartowo w
PCR – Taq wytrzymuje temperaturę 94-95 stopni C.
Przy fragmentach bogatych w GC używa się polimeraz
bardziej opornych na wysoką temperaturę (np. Pwo,
Pfu).

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

94

0

C

Pierwszy cykl

background image

Annealing

(przyłączanie starterów)

Przyłączanie starterów (

Annealing)

Temperatura:

za wysoka – słaba wydajność

za niska - niespecyficzne powielanie

Stosuje się temperaturę około 3-5 stopni poniżej
oszacowanej temperatury topnienia.
Praktyczny wzór na temperaturę topnienia dla starterów
o długości około 20 nukleotydów:
T=2x(A+T) + 4(G+C)

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

background image

Extension (wydłużanie łańcucha)

Wydłużanie łańcucha (Extension)

Temperatura tej części cyklu zależy od właściwości polimerazy.
Dla polimerazy Taq optymalna jest temperatura 72-78 stopni.
Szybkość reakcji w optymalnych warunkach dla polimerazy Taq
wynosi około 2000 nukleotydów/min.
Do pełnej syntezy badanego fragmentu czas trwania tego etapu
wyznaczamy zakładając połowę optymalnej prędkości.

5’

3’

3’

5’

Sekwencja startera

5’

3’

5’

3’

Sekwencja startera

background image

Drugi cykl - denaturacja

5’

3’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

94

0

C

5’

3’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

background image

Przyłączanie starterów

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

background image

Wydłużanie nici (elongacja)

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

background image

W trzecim cyklu produkowany jest

już właściwy produkt

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

5’

background image

PCR

>1 000 000 cząsteczek

Wzros

t

liniow

y

Wzrost

wykładnicz

y

background image

Termostabilne polimerazy

DNA różnią się między sobą

odpornością

na wysoką temperaturę,

dokładnością wbudowywania

nukleotydów

i prędkością reakcji

background image

Temperatura jest najważniejszym

fizycznym czynnikiem wpływającym

na wynik w reakcji PCR

background image

PCR

Startery

1. długość 18-25 nukleotydów.
2. skład 40-60% GC.
3. nie powinny zawierać odwróconych

powtórzeń.

4.

temperatura

topnienia

podwójnoniciowej

cząsteczki

tworzonej

przez oba startery z matrycą powinna być
podobna.

5. na końcu 3’ powinny mieć G lub C,

ale nie więcej niż jeden nukleotyd.

background image

Zbyt niska

temperatura

wiązania starterów

prowadzi do

powstania

niespecyficznych

produktów PCR

background image

Różne odmiany

metody PCR

background image

Analiza polimorfizmu powtarzalnych sekwencji DNA

background image

RFLP PCR – polimorfizm długości

fragmentów restrykcyjnych

background image

POLIMORFIZM W KODONIE 145 GENU APE1,

ROZKŁAD CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

TT(Asp/Asp)

TG(Asp/Glu)

GG(Glu/Glu)

GENOTYPY

%

B

A

D

A

N

E

J

P

O

P

U

L

A

C

JI

CHORZY Z
NOWOTWORAMI
REGIONU GŁOWY I SZYI

CHORZY Z RAKIEM PŁUC

CHORZY Z RAKIEM
SZYJ KI MACICY

CHORZY Z RAKIEM
J ELITA GRUBEGO

ZDROWI

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

CHORZY NA

NOWOTWORY

REGIONU GŁOWY I

SZYI

CHORZY NA RAKA

PŁUC

CHORZY NA RAKA

SZYJ KI MACICY

CHORZY NA

NOWOTWORY

J ELITA GRUBEGO

ZDROWI

ROZKŁAD CZĘSTOŚCI ALLELI GENU 145 APE 1

Asp

Glu

Porównanie

częstości

genotypów w

stanach

patologicznych

wskazuje na

istnienie korelacji

pomiędzy pewnymi

wariantami

genetycznymi

a chorobami

Pewne allele tego samego

genu mogą być

odpowiedzialne

za wystąpienie stanów

patologicznych lub

skłonności do określonych

patologii

A. Gdowicz 2005

background image

„Odwrócony” PCR

Używany do powielenia fragmentu o nieznanej
sekwencji, występującego w sąsiedztwie znanej
sekwencji DNA

background image

PCR jako źródło DNA do

klonowania

background image

Polimeraza Taq dodaje często

dodatkowy nukleotyd (A) do

końca 3’

Do

klonowania

można

wykorzystać

tzw. wektory T, które posiadają lepki
koniec

pojedynczy

nukleotyd

tymidynowy, albo usunąć dodatkowy
nukleotyd A.
Można też użyć polimerazy DNA z faga
T4,
lub

polimerazy

Pfu,

a

następnie

wklonować wstawkę w zdefosforylowany
wektor o tępych końcach.

background image

Multiplex PCR

Wykorzystywana więcej niż jedna

para starterów.

Pozwala

na

powielenie

kilku

fragmentów DNA w jednej reakcji.

Warunki reakcji muszą być jednakowe

dla

wszystkich

par

starterów,

a

produkty

powinny

różnić

się

długością.

background image

Hot start PCR

Metoda

ułatwiająca

optymalizację

otrzymywania pożądanego fragmentu
DNA.

Dopiero po ogrzaniu do temperatury

wyższej

niż

temperatura

niespecyficznego

wiązania

starterów

wszystkie

składniki

mieszaniny

reakcyjnej są łączone ze sobą.

Obecnie taki efekt osiąga się przez

rozdzielenie części mieszaniny reakcyjnej
przy

pomocy

niskotopliwego wosku

(np. Ampliwax PCR Gems)

background image

PCR dla szczególnie długich

fragmentów DNA (long PCR)

Doskonała jakość matrycy DNA o długości

średnio powyżej 50 kb

Mieszanina polimeraz o różnych

charakterystykach

Dłuższe startery (24-34 pz)
Wyższa temperatura topnienia dla starterów

(najlepiej 63-68

0

C)

Minimalne czasy denaturacji (12 sekund) aby

uniknąć degradacji DNA

Znacznie wydłużone czasy syntezy, zwiększające

się jeszcze wraz z ilością cykli

background image

Zagnieżdżony (nested) PCR

Pierwsza para
starterów,
pierwsza reakcja
PCR

Druga para
starterów, druga
reakcja PCR

background image

Mieszaniny polimeraz

DyNAzyme

mieszanina

polimerazy Taq (duża szybkość

reakcji) oraz Tbr (duża dokładność)

Taq Plus Long PCR System –

mieszanina polimerazy Taq oraz

Pfu (dobra procesywność)

background image

Do powielania

fragmentów

metodą PCR

można użyć

zarówno DNA

jak i RNA

background image

Sekwencjonowanie

background image

Sekwencjonowanie

DNA

(metoda dideoxy-)

Jest enzymatyczną reakcją
używaną

w

odczytywaniu

sekwencji nukleotydowej DNA
uprzednio sklonowanego.

Metoda oparta jest na
użyciu

czterech

zatrzymujących

reakcję

wydłużania

łańcucha

nukleotydów, które w pozycji
3’ mają H zamiast OH (di-
deoxy: ddATP, ddGTP, ddCTP,
ddTTP).

W klasycznej metodzie każdy
nukleotyd

dodawany

jest

oddzielnie

do

czterech

prowadzonych

równolegle

reakcji replikacji DNA.

Produkty

tych

czterech

reakcji są rozdzielane metodą
elektroforezy
w żelu poliakrylamidowym

Nukleotydy dideoxy- powodują
zakończenie replikacji DNA

background image

Sekwencjonowanie

DNA

C

G

background image

Znakowanie
sekwencjonowane
go

fragmentu

pojedynczym
nukleotydem

background image

Znakowanie końcowego

nukleotydu (dideoxy)

background image

Odczytywanie sekwencji DNA

background image

Metoda chemiczna sekwencjonowania polega na

wykorzystaniu specyficznych wobec

poszczególnych zasad reakcji chemicznych, co

pozwala na identyfikację miejsca występowania

danej zasady

Zasada

Specyficzna modyfikacja

G

Metylacja N7 dimetylosiarczanem w pH 8.0
sprawia, że wiązanie C8-C9 staje się specyficznie
wrażliwe na rozkład przy pomocy zasady.

A+G

Mrówczan piperydyny w pH 2.0 osłabia wiązania
glikozydowe puryn, co powoduje depurynację

C+T

Hydrazyna otwiera pierścień pirymidynowy, który

następnie recyklizuje w formę podatną na
usunięcie

C

W obecności 1.5 M NaCl jedynie cytozyna reaguje
specyficznie z hydrazyną

A>C

1.2 N NaOH w temp. 90

0

C powoduje częste

przecinanie reszt A i rzadsze - C

Piperydyna przecina łańcuch fosfocukrowy w miejscu modyfikacji zasady

background image

Odczytywanie sekwencji

background image

Specyficzne znakowanie jednej

nici DNA przy użyciu fragmentu

Klenowa polimerazy I

background image

Sekwencjonowanie automatyczne
W systemie tym stosuje się nukleotydy dideoxy lub startery
znakowane czterema różnymi znacznikami fluorescencyjnymi.
Można stosować sekwencjonowanie rozpoczynające się od jednego
startera
i zatrzymujące się na znakowanych nukleotydach dideoxy.
Wszystkie cztery znakowane nukleotydy dideoxy występują wtedy
w jednej mieszaninie.
Inną możliwością jest stosowanie znakowanych starterów,
prowadzenie czterech niezależnych reakcji, a następnie rozdział na
jednej ścieżce żelu. Po reakcji mieszanina nanoszona jest na żel
poliakrylamidowy,
a elektroforeza prowadzona jest w aparacie wyposażonym w
detektor promieniowania.

background image

System

ABI

(Applied

Biosystems

Incorporated)

używa

czterech

znakowanych

fluorescencyjnymi

barwnikami

ddNTPs

i polimerazy Taq

(AmpliTaq).

background image

Wzbudzanie fluorochromów i detekcja emisji
mają miejsce w określonej pozycji w pobliżu
dolnej części żelu. Dane są odczytywane na
podstawie spektrum emisyjnego kolejnych pasm
mijających

detektor

w czasie elektroforezy. Dane przekazywane są
do komputera podłączonego do urządzenia

.

background image

Sekwencjonowanie cykliczne

(połączenie metody PCR i

sekwencjonowania) pozwala

na liniową amplifikację sygnału

background image

Enzymy używane

do sekwencjonowania

Sekwenaza

-

zmodyfikowana

wersja

polimerazy bakteriofaga T7, nie mająca
aktywności 3’-5’ egzonukleazy. Wydajne
włączanie

dideoksy-nukleotydów

zapewnia

obecność

tyrozyny

w pozycji 667 enzymu.

Termostabilne zmodyfikowane polimerazy
- AmpliTaqFS (fluorescent sequencing)
Taquenase
ThermoSequenase

background image

Budowa polimeraz wykorzystywanych

w sekwencjonowaniu

background image

Kompresja w żelu

7-deaza-dGTP

dITP

background image

Sekwencjonowanie długich

fragmentów DNA – metoda

shotgun

background image

Etapy

sekwencjonowania

1. Oczyszczanie DNA z wektora o dużej pojemności (kosmid,

BAC itp.)

2. Ligacja wewnątrzcząsteczkowa (cyrkularyzacja)
3. Rozrywane cząsteczek DNA na fragmenty (sonikowanie,

nebulizacja, trawienie Dnazą I w obecności Mn

2+

)

4. Naprawa końców DNA:

polimeraza faga T4
fragment Klenowa polimerazy I DNA
kinaza polinukleotydowa faga T4

5. Frakcjonowanie fragmentów DNA w żelu agarozowym

lub poliakrylamidowym

6. Ligacja z wektorem M13, transformacja bakterii
7. Izolacja poszczególnych klonów na płytkę mikrotitracyjną
8. Sekwencjonowanie przy użyciu uniwersalnego startera
9. Komputerowe składanie sekwencji we właściwej

kolejności

background image

Na ćwiczenie 2 proszę przygotować:
1. budowa komórek prokariotycznych i
eukariotycznych.
2. zadania z rozcieńczeń roztworów
Na ćwiczenie 3:
1. budowa DNA i zasad azotowych
2. instrukcja do ćwiczeń – działanie odczynników
w izolacji DNA (wstęp teoretyczny)


Document Outline


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
W5 sII PCR i sekwencjonowanie cz 2
BMiGO Wykład 4 PCR, Sekwencjonowanie
Wyklad 4 PCR, Sekwencjonowanie
W5 sII PCR i sekwencjonowanie cz 2
W4 Metody powielania sekwencji DNA
W4 Proces wytwórczy oprogramowania
W4 2010
Statystyka SUM w4
w4 3
W4 2
W4 1
w4 skrócony
w4 orbitale molekularne hybrydyzacja
in w4
w4 Zazębienie ewolwentowe

więcej podobnych podstron