Zastosowanie technik

biologii molekularnej w

diagnostyce chorób

dziedzicznych

Choroba dziedziczna

• schorzenie spowodowane przez mutacje jednego

lub więcej genów lub też aberrację
chromosomalną przekazywane w rodzinie w
kolejnym pokoleniu

• zmiany w DNA zostają przekazane w gametach

rodziców bądź też pojawiają się we wczesnych
etapach rozwoju zarodkowego (jako mutacje de
novo)

Test genetyczny

• analiza ludzkiego DNA, RNA, chromosomów,

białek i określonych metabolitów

• umożliwia identyfikację odpowiednich

genotypów, mutacji, fenotypów lub
kariotypu

• wykonywany do celów klinicznych i

poradnictwa genetycznego

Cel wykonywania testu

genetycznego

• zdiagnozowanie genetycznej przyczyny

choroby

lub

• wykazanie, że osoba posiada jedna lub więcej

zmian genetycznych:

– mogących spowodować rozwój choroby lub
– mogących wywołać chorobę u potomstwa lub
– mających znaczenie dla postępowania

leczniczego.

Testy genetyczne

oparte na analizie DNA

• niezależne od znajomości patogenezy choroby

• niezależne od ekspresji badanego genu

• wynik testu niezależny od momentu wystąpienia

objawów klinicznych czy zmian w środowisku

mogących wpływać na ujawnienie się kliniczne

genotypów

• wynik testu stały w ciągu całego życia

Materiał do badań DNA

- krew obwodowa,
- hodowla fibroblastów skóry,

- plamy krwi,

- komórki nabłonka jamy ustnej,

- cebulki włosowe,

do badań prenatalnych:

- komórki płynu owodniowego,

- komórki trofoblastu (możliwość analizy w I trymetrze

ciąży)

Specyficzność analizy nie zależy od

rodzaju tkanki użytej do badania.

Strategie metodyczne w

diagnostyce molekularnej

bezpośrednia
analiza mutacji

analiza sposobu
dziedziczenia
danego genu (analiza
sprzężeń)

Analiza sposobu

dziedziczenia (analiza

sprzężeń)

• polega na na śledzeniu w rodzinie

przekazywania określonego markera

genetycznego sprzężonego ze zmutowanym

genem

• wykorzystuje fakt kosegregacji loci markera i

genu powodującego chorobę – marker i gen ze

względu na bliskie położenie na chromosomie

dziedziczą się wspólnie

Markery genetyczne

stosowane w analizie

sprzężeń

Marker genetyczny – dowolna sekwencja DNA

możliwa do identyfikacji, występująca w co najmniej

dwóch formach allelicznych

1. SNP

- Southern blotting,
- PCR-RFLP,

- PCR-ASO,

- sekwencjonowanie,

- mikromacierze

2. Sekwencje powtórzone (np. mikrosatelitarne)

- ocena wielkości produktu PCR w żelu

poliakrylamidowym

Analiza sposobu

dziedziczenia (analiza

sprzężeń)

• możliwa nawet przy brak

znajomości/możliwości bezpośredniej

identyfikacji mutacji chorobotwórczej

• konieczność badania rodziców chorego

• nie służy do weryfikacji rozpoznania

klinicznego

(opiera się na nim)

• umożliwia wykrycie nosicielstwa u krewnych

chorego

• obciążona ryzykiem błędu wynikającego ze

zjawiska rekombinacji (

badanie co najmniej dwóch

markerów)

Analiza sposobu dziedziczenia markera XV2C sprzężonego z

genem CFTR w rodzinie ryzyka mukowiscydozy.

Strategie metodyczne w

diagnostyce molekularnej

bezpośrednia
analiza mutacji

analiza sposobu
dziedziczenia
danego genu (analiza
sprzężeń)

Bezpośrednia analiza

mutacji

• weryfikuje rozpoznanie kliniczne

• brak ryzyka błędu diagnostycznego wynikającego

ze

zjawiska rekombinacji

• konieczna znajomość mutacji powodującej

chorobę

Współczesna rutynowa diagnostyka

molekularna

– głównie analiza znanych

mutacji.

Bezpośrednia analiza

mutacji

przeszukiwanie genu

poszukiwanie

konkretnej

mutacji/grupy mutacji

• nie wiadomo, która z licznych mutacji

powoduje defekt genu

• w populacji brak mutacji specyficznych o

dużej częstości występowania

 sekwencjonwanie, poprzedzone badaniem

metodą przesiewową (SSCP, HA, DGGE)

Przeszukiwanie genu

Bezpośrednia analiza

mutacji

przeszukiwanie genu

poszukiwanie

konkretnej

mutacji/grupy mutacji

Poszukiwanie konkretnej

mutacji

- mutacje punktowe

1) analiza restrykcyjna

- PCR-RFLP
- Southern blotting

2) PCR-ASO
3) sekwencjonowanie
4) mikromacierze DNA

Analiza mutacji punktowej w genie -globiny powodującej

anemię sierpowatokrwinkową (Southern blotting).

Poszukiwanie konkretnej

mutacji

– insercje, delecje, duplikacje

1) analiza wielkości produktu PCR – małe delecje

2) Southern blotting – duże delecje lub duplikacje,

– duże powtórzenia trójnukleotydowe,

Analiza delecji 508 w rodzinie ryzyka mukowiscydozy

(analiza długości produktu PCR)

1. Czym spowodowane są choroby dziedziczne?
2. Co to jest test genetyczny i do czego służy?
3. Jaki materiał stosuje się do badania DNA w

diagnostyce chorób dziedzicznych?

4. Na czym polega i do czego służy analiza

sposobu dziedziczenia?

5. Na czym polega przeszukiwanie genu? Jakie

techniki się tu wykorzystuje?