Zadania hodowle tkankowe 08.06.16

Obliczenie wpływu kwercetyny (jest to polifenol o masie molowej M=302 g/mol) na komórki HeLa.
Związek ten nie jest rozpuszczalny w wodzie (w laboratorium jest on w postaci stałej a nie roztworu)

Pkt 1. Uzyskać 1 ml kwercetyny o stężeniu 100 mM.

M= 320g/mol

V= 1 ml=0,001 dm^3

C= 100 mM=0,1M=0,1 mol/dm^3

Korzystając z tego wzoru :

Aby otrzymać 1 ml roztwór o stężeniu 100mM należy w 1ml rozpuszczalnika (np. etanol) rozpuścić naważkę kwercetyny o masie .

Pkt. 2 Płytka wielodołkówa ma 96 dołków. W każdym z tych dołków jest już 100 µl podłoża z zawieszonymi w nim komórkami. Ile roztworu otrzymanego w pierwszym punkcie, czyli o stężeniu C= 100 mM musimy dodać do dołka aby otrzymać w nim stężenie kwercetyny 5 µM.

Korzystamy ze wzoru:

Aby otrzymać 5 µM stężenie kwercetyny w dołku musimy do niego dodać 0,005µl roztworu tego związku o stężeniu 100 mM

Pkt 3. Nie istnieje pipeta którą dałoby się pobrać tak małą objętość cieczy, roztwór kwercetyny musi być dodawany w większej objętości (przynajmniej 0,1 µl bo tyle możemy odmierzyć pipetą). W tym celu trzeba zmniejszyć jego stężenie:

Wykonuje się to metodą rozcieńczeń, chcemy uzyskać końcowe stężenie 1 mM (roztwór wejściowy ma stężenie 100mM):

Aby uzyskać 1ml roztworu kwercetyny o stężeniu 1mM, należy rozcieńczyć 100x roztwór wejściowy czyli roztwór 100mM, tzn do 10 µl roztworu wejściowego należy dodać 990 µl rozpuszczalnika.

W ten sposób aby otrzymać stężenie w dołku 5 µM, należy dodać do niego wg następującego równania:

0,5 µl roztworu o stężęniu 1mM (1000 µM)

Pkt 4.Na płytce wielodołkowej chcemy przeprowadzić doświadczenie polegające na określeniu wpływu stężenia na aktywność komórek. W tym celu w kolejnych rzędach dołków na płytce (w każdym rzędzie jest 6 dołków) potrzebujemy roztworu o innym stężeniu kwercetyny kolejno

Nr. rzędu	Stężenie jakie chcemy osiągnąć [µM]
1	0 (próba kontrolna)
2	1
3	5
4	10
5	25
6	50
7	100

Problem polega na tym że jeśli kierowalibyśmy się powyższymi rachunkami, w każdym dołku otrzymalibyśmy inną objętość, a to wpłynęłoby np. na stężenie komórek, jako że działamy na małych objętościach ma to duży wpływ i podczas badania absorbancji zrobilibyśmy duży błąd. W takim wypadku musimy zauważyć że im większe stężenie kwercetyny chcemy uzyskać w dołku tym większą objętość roztworu tego związku dodajemy czyli w przypadku 100 µM dodamy największa objętość która wyniesie:

Dziesięć mikromoli. Aby wystandaryzować objętość w dołkach musimy dodawać do niej 10µl cieczy. I tak:

Do 100 µl podłoża z komórkami w dołku dodamy 10µl 1mM roztworu kwercetyny uzyskując tym samym stężenie 10 µM kwercetyny w podłożu

Następnie należy dwukrotnie rozcieńczyć 5µl 1mM roztwór kwercetyny dodając do niego 5µl rozpuszczalnika (tym razem rozcieńczamy medium a nie etanolem, dlatego że etanol ma właściwości toksyczne i jeśli badamy stężenie związku wpływające hamująco na komórki wynik będzie sumą działania kwercetyny i etanolu a nie samej kwercetyny) uzyskując tym samym 10 µl roztwór o stężeniu 0,5 mM.

Uwaga na zmianę jednostki (strzałka)

A następnie dodać go do płytki gdzie uzyskamy stężenie:

W taki sposób zarówno w pierwszym jak i w drugim dołku mamy 110µl cieczy ale w różnych stężeniach i o to nam chodziło. Poniższa tabela pokazuje rozwiązania dla dalszych stężeń:

Stężenie w dołku [mikroM]	Objętość 1 mM roztworu kwercetyny	Objętość rozpuszczalnika[mikrolitr]	Objętość końcowa rozcieńczonego roztworu kwercetyny [mikrolitr]	Objętość końcowa dołka [mikrolitr]
0	0	10	0	110
100	10	0	10	110
50	5	5	10	110
25	2,5	7,5	10	110
10	1	9	10	110
5	0,5	9,5	10	110
1	0,1	9,9	10	110

Należy jednak zauważyć że prowadzone obliczenia są na jeden dołek, dla każdego stężenia w rzeczywistości nie robi się każdorazowo rozcieńczeń tylko przygotowuje się objętość końcową rozcieńczonego roztworu badanej substancji taką aby wystarczyła na wszystkie dołki i dopiero się ją rozdziela, (jest 6 dołków ale żeby mieć pewność że roztworów wystarczy przygotowuje się je z nadwyżką np. nie na 6 tylko na 10 dołków. W związku z tym wartości kolumn 2, 3 i 4 w powyższej tabeli należy pomnożyć przez 10)

pkt 5 gęstość zawiesiny komórek jaką mamy w dołkach również musi być standaryzowana, aby doświadczenie było przeprowadzane w takich samych warunkach w każdym dołku:

Mamy uzyskać 10 ml (tak żeby było 100 µl podłoża z komórkami w każdym z 96 dołków [0,4 ml zapasu]). Mamy 1 ml strypsynowanego roztwóru komórek HeLa (przez co są one odklejone od podłoża), w którym jest 10 000 000 komórek, chcemy aby w każdym dołku było 10 000 komórek.

Na jeden dołek

Na całą płytkę

Ale żeby uzyskać 10 ml należy wszystko pomnożyć razy 100

czyli

Pkt 6 Tabela z wynikami absorbancji

Z każdej kolumny tabeli oblicza się średnią z absorbancji a następnie każdą komórkę tabeli w której jest wynik absorbancji z próby dzieli się przez średnią absorbancji z prób kontrolnych (mamy w tedy wynik względem proby kontrolnej) i jako że ma to wychodzić w wartości procentowej mnożymy razy 100%. Obliczamy także średnią z tych wyników i odchylenie standardowe (wartość ta pokazuje w jakich granicach jest mierzona wartość) a następnie zaznaczamy to na wykresie kolumnowym na osi Y odznaczając np. procent aktywności komórek względem próby kontrolnej a na osi X stężenie kwercetyny w dołkach w danym rzędzie. W ten sposób mamy pogląd w jakich granicach znajduje się:

EC₁₀ – pierwsza dawka toksyczna stężenie hamujące aktywność komórek o 10% (parametr mierzony przyjmuje wartość 10%)

EC₅₀ – wpływ na zmniejszenie parametru badanego 50% parametr badany przyjmuje wartość 10%

EC₉₀ – dawka letalna wpływ na zmniejszenie parametru badanego (stężenie hamujące aktywność komórek w 90%), parametr badany przyjmuje wartość 10%.

Nie możemy jednak wyznaczać zależności na tym wykresie (w sensie linia trendu równanie z którego wyliczymy te parametry) tylko muszą one być empirycznie zbadane (musi wyjść na wykresie), a jak nie wyjdzie na wykresie to powtarza się badanie tylko w stężeniach dobranych w granicach tego co chcemy osiągnąć, żeby wyszło. Te badane aktywności często nagle przestają mieć linową zależność od stężęnia związku.

Hormeza- sytuacja w której mała ilość związku toksycznego powoduje wzrost aktywności komórek. Ta sama substancja w większych stężeniach działa na nie hamująco.