1

Chemia Analityczna

Chromatografia

Tłumaczyła: inż. Karolina Hierasimczyk

Korekta:

dr hab. inż. Waldemar Wardencki, prof. nadzw. PG

prof. dr hab. inż. Jacek Namieśnik

Część II

Terminy i definicje.

Katedra Chemii Analitycznej

Wydział Chemiczny

Politechnika Gdańska

2002

2

SPIS TREŚCI
Wprowadzenie
1. Co to jest chromatografia?
1.1. Proces chromatograficzny
1.2. Podział metod chromatograficznych
1.3. Co to jest chromatografia gazowa?

2. Terminy i definicje .........................................................................................................II/2
2.1. Czas retencji (t

R

) .........................................................................................................II/3

2.2. Współczynnik retencji (k) ............................................................................................II/3
2.3. Indeks retencji (I) ......................................................................................................II/12
2.4. Współczynnik rozdzielenia .......................................................................................II/14
2.5. Teoretyczna liczba półek (N) lub sprawność kolumny .............................................II/14
2.6. Rozdzielczość (R

S

) ....................................................................................................II/17

2.7. Stosunek faz (β) .........................................................................................................II/21

3. Kolumny kapilarne do chromatografii gazowej
3.1. Fazy stacjonarne
3.1.1. Polisiloksany
3.1.2. Glikole polietylenowe
4. Gazy nośne
5. Dozowniki
5.1. Dozowniki wykorzystujące odparowanie
5.2. Dyskryminacja związków dozowanych
5.3. Opłukiwanie membrany
5.4. Dozowanie na kolumnę typu „Megabore”
5.5. Dozowniki z dzieleniem strumienia gazu (split)
5.6. Dozownik bez podziału strumienia gazu
6. Detektory w GC
6.1. Detektor cieplno-przewodnościowy (TCD)
6.2. Detektor płomieniowo – jonizacyjny (FID)
6.3. Detektor wychwytu elektronów (ECD)
6.4. Detektor azotowo fosforowy (NPD)
6.5. Detektor płomieniowo – fotometryczny (FPD)
6.6. Detektor fotojonizacyjny (PID)
6.7. Spektrometr mas (MS)
7. Analiza ilościowa

3

2. Terminy i definicje

2.1. Czas retencji (t

R

)

Czas retencji (t

R

) jest to czas, w którym substancja przechodzi przez kolumnę. Czas retencji

przypisany jest pikowi odpowiadającemu danej substancji. Czas zatrzymania składnika jest

miarą ilości czasu jaki substancja rozpuszczona spędza w kolumnie. Jest sumą czasu

spędzonego w fazie stacjonarnej i w fazie ruchomej.

Czas retencji nie zatrzymywanego związku

Czas retencji substancji nie zatrzymywanej lub czas martwy (t

M

lub t

O

) to czas w jakim nie

zatrzymywany związek przechodzi przez kolumnę. Nie zatrzymane cząsteczki substancji

rozpuszczonej nie oddziałują z fazą stacjonarną, lecz przemieszczają się w dół kolumny z tą

samą szybkością z jaką przemieszcza się strumień gazu nośnego. Jest to równoważne z

czasem jaki związek spędza w fazie ruchomej. Czas martwy piku otrzymany jest poprzez

dozowanie substancji nie zatrzymywanych i określeniu ich czasu retencji.

2.2. Współczynnik retencji (k)

Współczynnik retencji (k) jest inną miarą retencji. Jest to stosunek

ilości czasu jaki substancja rozpuszczona spędza w fazie stacjonarnej i

ruchomej (gaz nośny).

4

Obliczony jest za pomocą równania 1. Współczynnik retencji wcześniej nazywany był

współczynnikiem podziału lub współczynnikiem pojemnościowym. Ponieważ wszystkie

substancje rozpuszczone spędzają tę samą ilość czasu w fazie ruchomej, współczynnik

retencji jest miarą retencji przez fazę stacjonarną. Jest pomiarem względnym i ma charakter

liniowy. Na przykład, substancja o k = 6 jest podwójnie tak zatrzymana przez fazę stacjonarną

(nie przez kolumnę) jak substancja o k = 3. Współczynnik retencji nie dostarcza wszystkich

informacji o zatrzymaniu składnika; dostarcza informacje o względnej retencji. Dla nie

zatrzymywanej substancji k = 0.

Współczynnik retencji (k)

k = (t

R

– t

M

) / t

M

= t’

R

/ t

M

(1)

t

R

= czas retencji

t’

R

= redukowany czas retencji

t

M

= czas retencji związku nie zatrzymywanego

KSZTAŁT PIKU

Dyfuzja jest powszechnie obserwowanym zjawiskiem. Jakakolwiek część niezwiązanych

cząsteczek będzie dążyć do rozproszenia w zajmowanej objętości. Jeżeli tak się dzieje to

następuje spadek ich stężenia i wzrasta ich entropia. Dlatego spełnione jest jedynie drugie

prawo termodynamiki. Mówiąc o dyfuzji, często myśli się o cząsteczkach poruszających się z

obszaru o wysokim stężeniu do obszaru o niskim stężeniu. Takie założenie, z góry przyjmuje,

iż cząsteczki są ‘świadome’ obszarów o wysokim i niskim stężeniu. W rzeczywistości dyfuzja

odbywa się we wszystkich kierunkach ponieważ ruchy cząsteczek są przypadkowe.

Ostatecznie jednak, obszar o niższym stężeniu cząsteczek zostanie w nie wzbogacony a

obszar o wyższym stężeniu ulegnie zubożeniu. Więcej cząsteczek popłynie z obszaru o

wyższym stężeniu do obszaru o niższym stężeniu, i nastąpi ogólne wyrównanie poziomu

stężenia.

Na początku profile substancji rozpuszczonej mają kształt symetrycznych pików, profile

stężenia jednak ulegają w czasie zmianom i przybierają odpowiednie kształty:

5

IZOTERMA SORPCJI

Ilość poszczególnej substancji zasorbowanej przez fazę stacjonarną zależy od stężenia w fazie

ruchomej. Stosunek pomiędzy ilością zasorbowaną a stężeniem w fazie ruchomej, przy stałej

temperaturze, nazywany jest izotermą sorpcji.

Sorpcja jest ogólnym pojęciem obejmującym kilka mechanizmów, takich jak, proces

adsorpcji (np. oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami substancji rozpuszczonej a

powierzchnią ciała stałego), podział (rozcieńczenie cząsteczek substancji rozpuszczonej w

cieczy), wymianę jonową (wymiana jonów substancji rozpuszczonej z jonami w fazie

stacjonarnej) i wykluczanie (ograniczenie dyfuzji cząsteczek substancji rozpuszczonej

poprzez porowatą fazę stacjonarną).

Izoterma sorpcji i kształt piku

Poniższe rysunki przedstawiają przebieg izotermy gdy stosunek pomiędzy stężeniem badanej

substancji w fazie stacjonarnej (Cs) i stężeniem substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej

(Cm) jest liniowy. Stosunek Cs / Cm określa nachylenie krzywej.

6

Jest on określony jako współczynnik podziału K.

System chromatograficzny, w którym relacja ta jest liniowa opisany jest jako chromatografia

liniowa, której efektem jest rozdzielenie substancji i uzyskanie pików typu gaussowskiego.

Powyższe rysunki ukazują izotermę liniową i charakterystykę pasma chromatograficznego z

którym jest związana.

Retencja w chromatografii

Poniższy rysunek przedstawia sytuację, w której próbka wprowadzona jest do kolumny w

fazie ruchomej. W praktyce, faza stacjonarna będzie rozproszona całkowicie w kolumnie ale

dla wygody możemy wyobrazić sobie, że zajmuje ona połowę kolumny i że faza ruchoma

zajmuje drugą połowę kolumny.

Gdy próbka (niesiona przez fazę ruchomą) zetknie się z fazą stacjonarną, rozdzieli się miedzy

te dwie fazy zgodnie z wartościami ich współczynników podziału (K

D

lub K). Jest to

równoważne z separacją w pierwszym „lejku” separacyjnym. Jednakże w przeciwieństwie do

lejka separacyjnego, nie trzeba czekać aby otworzyć zawór lejka i pozwolić próbce

przepłynąć do drugiego lejka. Nie musimy także czekać aż próbka osiągnie równowagę

pomiędzy dwoma fazami zanim przejdzie do drugiego kroku separacji. Oznacza to, że jeżeli

równowaga ma być osiągnięta, musi to nastąpić natychmiastowo. Gdy już jest rozdzielona

pomiędzy dwie fazy, próbka pozostająca w fazie ruchomej będzie poruszać się dalej w dół

kolumny napotykając „nową” fazę stacjonarną. Próbka ponownie poruszać się będzie z fazy

7

ruchomej do fazy stacjonarnej (proces ten zwany jest sorpcją) aż ponownie zostanie

osiągnięta równowaga. Ponieważ stężenie próbki w fazie ruchomej w pierwszej sekcji zostało

zmniejszone, próbka przemieszczać się będzie z fazy stacjonarnej z powrotem do fazy

ruchomej (proces ten nazywany jest desorpcją) w celu utrzymania stałej wartości

współczynnika podziału. Proces ten zobrazowany jest na Rysunku (ii). W bardzo krótkim

czasie cała próbka zostanie zdesorbowana z fazy stacjonarnej w pierwszej sekcji kolumny i

porwana przez fazę ruchomą do drugiej sekcji kolumny. Ostatecznie, równowaga znowu

zostanie ustalona a próbka w całości znajdzie się w drugiej sekcji kolumny (Rys. (iii)). Proces

sorpcji i desorpcji będzie trwał (Rys. (iv)) aż próbka dojdzie do końca kolumny i zostanie

wymyta z kolumny.

Chromatografiści nie stosują terminu – lejki separacyjne lub sekcje kolumn ale zapożyczają

terminologię z techniki destylacji, z którą chromatografia ma pewne cechy wspólne. Przez

analogię z destylacją, każda sekcja kolumny chromatograficznej w której przyjmuje się, iż

równowaga została osiągnięta znana jest jako półka teoretyczna.

Przyjrzeliśmy się procesowi chromatograficznemu, który przebiega jako seria dyskretnych

kroków tak jak w przypadku lejka separacyjnego. Ale chromatografia jest dynamicznym

procesem a nie serią statycznych kroków. Jednakże, czyniąc nasze kroki lub ‘teoretyczne

półki’ bardzo małymi, procesy statyczne i dynamiczne stają się równoważne.

Długość kolumny odpowiadająca teoretycznym półkom nazwana jest Wysokością

Równoważną Półce Teoretycznej (Height Equivalent to a Theoretical Plate - HETP lub

H). Im mniejsza wartość H tym więcej kroków równoważnych zawiera kolumna (jest to

równoważne z przeprowadzaniem dużych ilości kolejnych separacji w lejku) i przyjmuje się,

że kolumna posiada dużą sprawność. W praktyce, oznacza to że kolumna sprawdziłaby się

lepiej przy separacji składników mieszanin.

Odnosząc się ponownie do rysunków przedstawianych powyżej, jeżeli strzałki wskazują

kierunek, w którym poruszają się cząsteczki substancji, obserwujemy iż w fazie stacjonarnej

nie odbywa się ruch bezpośrednio wzdłuż kolumny. Cząsteczki poruszają się tylko przez

granicę pomiędzy fazą stacjonarną i fazą ruchomą, a wzdłuż kolumny tylko w czasie kiedy

znajdują się w fazie ruchomej. W fazie ruchomej, wszystkie cząsteczki poruszają się z taką

8

samą prędkością (µ), gdzie µ = prędkość liniowa fazy ruchomej, a więc czas spędzony w fazie

ruchomej jest taki sam dla wszystkich cząsteczek. Czas ten nazwany jest czasem retencji

substancji nie zatrzymywanej lub martwym czasem kolumny (t

M

).

Zróżnicowanie migracji wynika z czasu (t

S

) jaki różne substancje spędzają w fazie

stacjonarnej. Składnik (A) z niskim współczynnikiem podziału, K, w jakimkolwiek czasie

będzie posiadał mniej cząsteczek w fazie stacjonarnej w porównaniu do innego składnika (B)

z wyższym współczynnikiem podziału, dlatego będzie mniej opóźniony i szybciej przemieści

się przez kolumnę. W związku z tym, stosunek przemieszczania się składnika, (Rm), jest

odwrotnie proporcjonalny do wartości jego współczynnika podziału; stosunek

przemieszczania się

Rm proporcjonalne do 1 / K

Składniki mieszaniny będą odseparowane tylko wtedy gdy ich współczynniki podziału

pomiędzy fazą stacjonarną a fazą ruchomą będą się różniły.

Całkowity czas retencji składnika ( t

R

) jest sumą czasów spędzonych w fazie ruchomej i

fazie stacjonarnej:

t

R

= t

m

+ t

S

t

S

– zazwyczaj zwane jest zredukowanym czasem retencji, t’

R

W chromatografii gazowej przyjmuje się, że faza ruchoma (zazwyczaj azot, hel lub wodór)

nie wykazuje oddziaływania z próbką, np. nie wpływa na rozdzielenie cząsteczek próbki

pomiędzy fazami, które zależy tylko od oddziaływań międzycząsteczkowych między próbką a

fazą stacjonarną. Jedyną funkcją fazy ruchomej jest transport cząsteczek substancji

rozpuszczonej wzdłuż kolumny. W chromatografii cieczowej faza ruchoma opisana jest jako

interaktywna i odgrywa ważną rolę w rozdzielaniu składników próbki. Poprzez zmianę składu

chemicznego fazy ruchomej, rozkłady składników pomiędzy fazy stacjonarną i ruchomą

przyczyniają się do tego, iż stosunek ich migracji może być znacznie zmieniony. Dlatego w

chromatografii cieczowej, analityk może dodatkowo kontrolować selektywność.

Stosunek przemieszczania się pasma badanej substancji przez kolumnę jest odwrotnie

proporcjonalny do wartości współczynnika podziału. W wypadku izotermy liniowej, K nie

zależy od stężenia (tj. nachylenie krzywej jest stałe).

9

Dlatego też, chociaż powyższy rysunek przedstawia gradient stężenia w poprzek piku i

maksymalne stężenie znajdujące się w centrum piku, wartość K pozostanie stała w poprzek

piku. Oznacza to, że cały pik przemieszczać się będzie w tym samym stosunku a podstawowy

kształt pozostanie bez zmian tj. będzie miał charakter gaussowski. Jak zostało to już

przedstawione, w zasadzie pik będzie się rozmywał przechodząc wzdłuż kolumny z powodu

zjawiska dyfuzji, ale w obecnej dyskusji możemy pominąć ten fakt. W takim przypadku mówi

się o idealnej liniowej chromatografii, przy czym termin ‘idealna’ odnosi się do faktu, iż

dyfuzja została zignorowana.

W chromatografii adsorpcyjnej, izoterma ma kształt „wypukły” w stosunku do osi Cm

(izoterma typu Langmuir). Takie zachowanie ma miejsce w wypadku silnych oddziaływań

między analizowaną substancją a fazą stacjonarną, ale oddziaływania substancja /substancja

są stosunkowo słabe. Początkowo, ilość substancji zaadsorbowanej przez fazę stacjonarną

wzrasta szybko wraz ze wzrostem stężenia w fazie ruchomej, tak długo aż jednocząsteczkowa

warstwa substancji uformuje się na adsorbencie. Ponieważ oddziaływania pomiędzy

cząsteczkami substancji są słabe, przypadki adsorpcji, w których formowane są warstwy

jednocząsteczkowe i pewna ilość substancji zostaje zaadsorbowana, pozostają stałe nawet gdy

stężenie w fazie ruchomej później wzrasta. Dlatego współczynnik podziału jest wysoki przy

niskich wartościach Cm, ale maleje wraz ze wzrostem Cm.

Poniższy rysunek przedstawia kształt piku w odniesieniu do izotermy tego typu.

10

Oznacza to, że stosunek przemieszczania się nie jest teraz taki sam. Jeżeli oznaczy się stopień

przemieszczania się za pomocą strzałek, brzegi pasma, gdzie stężenie jest najniższe, będą

miały najwyższą wartość K i dlatego poruszanie się tej strefy następuje stosunkowo wolno w

porównaniu do centrum pasma gdzie panuje najwyższe stężenie a wartość K jest najniższa.

Dlatego centrum pasma porusza się szybciej docierając do rozmytej przedniej części piku i

pozostawiając za sobą ogon.

W układach podziałowych, izoterma zazwyczaj jest wklęsła do osi Cm (izoterma typu anty-

Langmuira). Ten rodzaj izotermy powstaje w wyniku silnych oddziaływań między

cząsteczkami substancji, a oddziaływania pomiędzy substancją a fazą stacjonarną są słabe.

Dlatego, przy niskich stężeniach, rozpuszczalność cząsteczek badanej substancji jest mała i

parametr K ma niską wartość, ale gdy kilka cząsteczek substancji rozpuści się w fazie

11

stacjonarnej, silne oddziaływania substancja /substancja wciągają kolejne cząsteczki do fazy

stacjonarnej i K wzrasta gwałtownie.

Jakiego kształtu piku należy się spodziewać w układzie podziałowym? Pik z rozproszonym

przodem i ostrym ogonem nazywany jest pikiem z rozmytą częścią przednią.

Należałoby rozważyć, że w przypadku izotermy typu anty-Langmuira K wzrośnie wraz ze

wzrostem stężenia w poprzek pasma, więc najniższe będzie na brzegach a najwyższe w

centrum piku. Dlatego stosunek przemieszczania się będzie najniższy w centrum a najwyższy

na brzegach. Ogon będzie dążył do środka a przód będzie odbiegał od środka przyczyniając

się do powstania piku z ostrym ogonem i rozmytym przodem (tj. rozmycie przedniej części

piku). Proces ten przedstawiono na rysunku.

1. Do asymetrycznego wzrostu piku przyczynić się może także kilka innych czynników,

a w szczególności powolne dozowanie do kolumny, ale mogą one zostać ograniczone

w wyniku dobrania odpowiednich warunków pracy.

12

Generalnie, ogonowanie i rozmycie przedniej części piku są szersze niż odpowiadający

kształt piku typu gaussowskiego. Poniżej widać, iż poszerzony pik nie sprzyja pełnemu

rozdzieleniu dwóch związków, więc takie zjawisko powinno być unikane.

W jaki sposób można temu przeciwdziałać?

Obie formy izoterm mogą być postrzegane jako liniowe jeżeli stężenie substancji jest

stosunkowo niskie. Dlatego, jeżeli dozowana ilość próbki do kolumny jest utrzymana na

niskim poziomie, piki typu gaussowskiego zazwyczaj będą otrzymane w przypadku izotermy

nieliniowej. W chromatografii gazowej i cieczowej dla typowej kolumny z wypełnieniem (4

mm śr.) wielkość próbki danego składnika w mieszaninie powinna być utrzymana poniżej 1

mg (0,1 µL jeżeli M = 100). W chromatografii gazowej z wypełnieniem stałym, wielkość

próbki musi być znacznie mniejsza jeżeli dąży się do otrzymania piku typu gaussowskiego.

Jeżeli wielkość próbki jest zbyt duża piki stają się zniekształcone a kolumnę uważa się za

przeładowaną.

Wpływ wielkości próbki na czas retencji analitów: A - kolumna nie przeładowana;
B – kolumna lekko przeładowana; C – kolumna mocno przeładowana;

2.3. Indeks retencji (I)

Indeks retencji (I) jest miarą retencji badanej substancji względem retencji

normalnych alkanów (łańcuch prosty) w danej temperaturze i dla danej kolumny.

Do obliczania indeksów retencji w warunkach temperatury izotermicznej stosuje się równanie

2a. W warunkach z programowaniem temperatury, można użyć równania 2b.

Masa próbki (Skala logarytmiczna)

13

Indeks retencji dla n-alkanów to liczba węgli pomnożona przez 100. Na przykład, n-dodekan

(n-C

12

H

26

) ma I = 1200. Jeżeli badana substancja posiada I = 1478, eluowana jest po n-C

14

a

przed n-C

15

, i bliższa jest n-C

15

. Indeksy retencji normalizują zmienne parametrów

przyrządów tak, że dane retencji mogą być porównywane dla różnych systemów GC. Indeksy

retencji dobrze służą również przy porównywaniu charakterystyk różnych kolumn.

Indeks retencji (I) w warunkach izotermicznych (2a)

I = 100y + [100 (z-y) (log t’

R(x)

– log t’

R(y)

)] / [ log t’

R(z)

– log t’

R(y)

]

Indeks retencji (IT) dla warunków z programowaniem temperatury (2b)

IT = 100 [ (t

R(x)

– t

R(y)

) / (t

R(z)

– t

R(y)

] + 100y

t

R

= czas retencji

x = badana substancja (analit)

y = n-alkany z liczbą y atomów węgla eluowane przed substancją rozpuszczoną x

z = n-alkany z liczbą z atomów węgla eluowane przed substancją rozpuszczoną x

z – y = różnica w liczbie węgli pomiędzy dwoma n-alkanami

14

2.4. Współczynnik rozdzielenia

α

Współczynnik rozdzielania jest miarą czasu lub odległości między

maksymalnymi wartościami dwóch pików.

Oblicza się go za pomocą równania 3. Jeżeli

α = 1, piki mają tę samą retencję i koeluują.

Współczynnik rozdzielania (

α)

α= k

2

/ k

1

(3)

k

1

= współczynnik retencji pierwszego piku

k

2

= współczynnik retencji drugiego piku

2.5. Teoretyczna liczba półek (N) lub sprawność kolumny

Sprawność kolumny wyrażona jest liczbą półek teoretycznych (N). Liczba półek

teoretycznych może być obliczona stosując równanie 4. Teoretyczne półki są pojęciem

umownym, ponieważ kolumna nie zawiera niczego co mogłoby przypominać fizycznie półki

destylacyjne albo inne podobne elementy.

Liczba teoretycznych półek jest pośrednią miarą szerokości piku dla piku o specyficznym

czasie retencji. Przyjmuje się, że kolumny z wyższą liczbą półek są bardziej sprawne niż

kolumny z mniejszą liczbą półek. Kolumna z dużą liczbą półek „wytwarzać” będzie węższe

piki w danym czasie retencji w porównaniu z kolumną o mniejszej liczbie półek.

15

Półki teoretyczne lub sprawność (N)

N = 5.545 [(t

R

) / w

h

]

2

(4)

N = 16[t

R

/ w

b

]

2

N = liczba półek teoretycznych

t

R

= czas retencji

w

h

= szerokość piku w połowie wysokości (w jednostkach czasu)

w

b

= szerokość piku w podstawie (w jednostkach czasu)

Wysoka sprawność kolumny ma szczególne znaczenie gdy należy rozdzielić nieduże piki.

Gdy stężenia substancji są większe, można użyć mniej efektywnych kolumn. Sprawność

kolumny jest funkcją wymiarów kolumny (średnicy, długości, i grubości filmu), rodzaju

gazu nośnego i jego natężenia przepływu lub średniej liniowej prędkości, oraz związku i jego

retencji. W celu porównania kolumn, często stosowana jest liczba teoretycznych półek na

metr (N/m).

Liczba teoretycznych półek ma znaczenie tylko w przypadku określenia konkretnych

warunków. Zwykle niezbędne są warunki temperatury izotermicznej a programowanie

temperatury przyczynia się do powstania nadmiernych półek. Także, współczynnik retencji

(k) testowanej substancji w celu obliczenia liczby półek powinien być większy od 5. Bowiem

mniej „zatrzymywane” piki przyczyniają się do nadmiernej liczby półek. Porównując liczby

półek teoretycznych dla różnych kolumn, wymaga się tych samych warunków

temperaturowych i retencji piku (k) aby porównanie było poprawne.

16

Wysokość równoważna półce teoretycznej (H)

Inną miarą sprawności kolumny jest wysokość

równoważna półce teoretycznej (H).

Jest ona obliczona za pomocą równania 5 i zazwyczaj podawana jest w mm. Im krótsza

każda z teoretycznych półek, tym więcej półek zawiera się w danym odcinku kolumny.

Przekłada się to na więcej półek teoretycznych na metr i wyższą sprawność. Małe wartości

wysokości równoważnych półce wskazują na wyższą sprawność.

Wysokość równoważna półce teoretycznej (H) (5)

H = L / N

L = długość kolumny (mm)

N = liczba półek teoretycznych

Asymetria

17

2.6. Rozdzielczość (R

S

)

Im wyższa rozdzielczość tym dwa piki nakładają się na siebie mniej.

Rozdzielenie to tylko odległość lub czas pomiędzy maksymalnymi wartościami (a) dwóch

pików. Rozdzielczość dotyczy zarówno odległości (a) i szerokości pików.

Może być ona obliczana z dwóch równań 6 (a i b).

18

Rozdzielczość (R

S

)

R = 1.18 [ (t

R2

-t

R1

) / (w

h1

+ w

h2

)] (6 a)

R = 2 (t

r2

-t

R1

) / (w

b1

+ w

b2

) (6 b)

t

R1

= czas retencji pierwszego piku

t

R2

= czas retencji drugiego piku

w

h1

= szerokość piku w połowie wysokości (w jednostkach czasu) – pik pierwszy

w

h2

= szerokość piku w połowie wysokości (w jednostkach czasu) - pik drugi

w

b1

= szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu) – pik pierwszy

w

b2

= szerokość piku przy podstawie (w jednostkach czasu) – pik drugi

Rozdzielczość „do linii podstawowej” zazwyczaj ma miejsce przy wartości R 1.50, jednakże,

nie ma wtedy linii podstawy pomiędzy pikami. Wartości większe od 1.50 wskazują na linię

podstawy między pikami. Wartości mniejsze niż 1.50 wskazują na koelucję piku. Przykłady

można znaleźć na poniższym rysunku.

Przykłady rozdzielczości

19

Czasami wartości rozdzielczości wyraża się w procentach. Są one obliczone ze stosunku

wysokości wgłębień pomiędzy pikami do całkowitej wysokości piku. Wartość tę łatwiej

można sobie wyobrazić niż liczbę rozdzielczości; jednakże, niemożliwe jest odróżnienie

poziomu rozdzielenia do linii podstawy.

Zmiany rozdzielczości jakie obserwuje się na chromatogramie przedstawiającym dwa piki dla

różnych wartości współczynnika separacji lub liczby teoretycznych półek. Średnia wartość

współczynnika separacji wskazana jest przez k.

20

21

2.7. Stosunek faz (β)

Stosunek faz kolumny (β) obliczony jest z równania 7. Dla tej samej fazy stacjonarnej i

temperatury kolumny (programowana lub izotermiczna), zmiana stosunku faz może być

wykorzystana w celu obliczenia zmiany retencji substancji. Zależność ta wyrażona jest za

pomocą równania 8.

Stała podziału (Kc) wyraża stosunek stężenia badanej substancji w fazie stacjonarnej i

ruchomej (C

S

/ C

M

). Stałe podziału są niezmienne dla tej samej fazy stacjonarnej, temperatury

kolumny i substancji rozpuszczonej.

Stosunek faz (β)

β = r / (2 d

f

) (7)

r = promień kolumny ( µm)

d

f

= grubość warstwy (µm)

Stała podziału (Kc)

Kc = C

s

/ C

M

(8)

Kc = k β = k [ r / (2 d

f

)]

C

s

= stężenie substancji rozpuszczonej w fazie stacjonarnej

C

M

= stężenie substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej

22

Dlatego, dla danej fazy stacjonarnej i temperatury kolumny, można określić ilość i kierunek

jakiejkolwiek zmiany retencji w zależności do zmian średnicy kolumny lub grubości filmu

fazy stacjonarnej. Równanie 8 wykazuje, iż wzrost stosunku faz daje odpowiedni spadek

retencji (k) gdy Kc jest wartością stałą. Odwrotnie, spadek stosunku faz przyczynia się do

odpowiedniego wzrostu retencji (k).

Równanie 8 wskazuje na to, że stosunek faz maleje wraz ze zmniejszeniem się średnicy lub

ze wzrostem grubości warstwy. Każda z tych zmian daje wzrost retencji badanej substancji.

Stosunek faz wzrasta ze wzrostem średnicy lub spadkiem grubości warstwy. Każda z tych

zmian daje spadek retencji substancji. Czasami pożądana jest zmiana średnicy kolumny lub

grubości warstwy po to aby otrzymać specyficzny efekt (wzrost sprawności), bez zmiany

retencji. Można tego dokonać poprzez proporcjonalną zmianę średnicy kolumny i grubości

warstwy.

Na przykład, jeżeli średnica kolumny zostanie zmniejszona z 0.25 do 0.18 mm, odpowiednia

zmiana grubości warstwy ( np. 0.25 µm – 0.18µm) utrzymuje ten sam stosunek faz. Starania

ogólne mają przyczynić się do utrzymania tej samej retencji osiągając zarazem wyższą

sprawność dzięki zmniejszeniu średnicy kolumny. W tabela 1 przedstawiono stosunki faz dla

kolumn o najczęściej spotykanych średnicach.

Tabela 1. Stosunek faz dla kolumn o najczęściej spotykanych średnicach.

Grubość warstwy

d

f

(µm)

Średnica kolumny

(mm)

0.10

0.18

0.20

0.25

0.32

0.45

0.53

0.10

250

450

500

625

800

1125

1325

0.18

139

250

278

347

444

625

736

0.25

100

180

200

250

320

450

530

0.40

63

113

125

156

200

281

331

0.42

107

119

149

190

268

315

0.50

90

100

125

160

225

265

0.83

60

75

96

136

160

0.85

59

74

94

133

156

1.00

50

63

80

113

133

1.27

49

63

88

104

1.50

42

53

75

88

2.55

25

31

44

52

3.00

21

27

38

44

5.00

13

16

23

27

23