1

METODY OCENY AKTYWNOŚCI UKŁADU IMMUNOLOGICZNEGO

1. metody oceny aktywności układu immunologicznego- istotne przy podejrzeniu

niedoborów immunologicznych

1.1 OCENA ODPOWIEDZI WRODZONEJ
1.1.1 ocena składowych dopełniacza- immunodyfuzja radialna, ELISA, nefelometria

1.1.2 ocena chemotaksji pod wpływem czynników andogennych (C3a,C5a, IL8) i
egzogennych (endotoksyny, zymosan)

- metoda „agarozowa” mierzy się na jaką odległość komórki ”odejdą” w
podłożu agarozowym od środkowej studzienki w kierunku czynnika
chemotaktycznego
- metoda „filtrowa” Boydena”- podzielona komora za pomoca filtra
miliporowego- (pory mniejsze od średnicy badanych komórek), w jednej
komorze badane komórki w drugiej roztwór czynnika chemotaktycznego-
badamy indeks chemotaktyczny- stosunek komórek które przeszły w obecności
czynnika chemotaktycznego w porównaniu do liczby komórek które przeszły
przez filtr kontrolny.

1..1.3 badanie zdolności fagocytarnych-

- metoda probówkowa- Drobnoustroje +zawiesina fagocytów---inkubacja---
--rozmazy na szkiełkach –liczymy

- metoda jednowarstwowa- ( od początku na szkiełku) opsonizowane
bakterie + fagocyty—inkubacja—odczyt ( drobnoustroje mogą być
znakowane fluorochromami- wtedy odczyt w mikroskopie
fluorescencyjnym)

1..1.4 badanie aktywności metabolicznej wewnątrzkomórkowej komórek:

A. test NBT,
B. pomiar zdolności wzbudzania chemiluminescencji
C. zdolnośc do redukcji cytochromu C

A. Co ocenia? zdolności generacji rodników ponadtlenkowych przez

neutrofile . test NBT test pochłaniania i redukcji NBT (błękitu
nitrotetrazolinowego)

NADH i NADPH wytwarzane w trakcie wybuchu tlenowego w fagocytach

mają zdolność redukcji związku NBT do formazanu (błękitne złogi)

Neutrofile inkubuje się z NBT-----odczyt ile % komórek jest NBT + (norma 8%)

podwyższone wartości – aktualna infekcja, obniżone wartości- przewlekła ch.
Ziarniniakowata, toczeń, pacjenci leczeni sterydami

1.3 ODPOWIEDŹ HUMORALNA

1.3.1 Oznaczanie poziomu przeciwciał w surowicy i ich podklas

1.4 ODPWOIEDŹ KOMÓRKOWA

2

- ocena fenotypu limfocytów
- metody oceny zdolności limfocytów do aktywacji

nieaktywowany limf T

Proliferacja
Komórki potomne

Późna faza aktywacji
DNA synteza

Wczesna aktywacja

APC

mitogen

TCR

CD69

CD25(IL2R)

HLA DR

CD71-transferrin receptor

Proliferacja limfocyt

Proliferacja limfocyt

ó

ó

w

w

Izolacja limfocytów

>48h hodowla

kontrolal

PHA, ConA,
specific antigens

Znacznik radioaktywny
3H tymidina

24h hodowla

Detekcja promieniowania

3

Ocena cytotoksyczno

Ocena cytotoksyczno

ś

ś

ci

ci

Wyznakowanie znakowanym

Chromianem sodu Na2CrO4

Dodanie cytotoksycznych

Limf T do wyznakowanych

komórek docelowych

Zabicie komórki uwalnia

Radioaktywny chrom

Test transformacji blastycznej

Izolowane limfocyty ---hodowla z miogenami (laktynami)
Równolegle hodowla bez czynnika mitotycznego
Po inkubacji kilkudniowej ocenia się liczbę komórek ulegających transformacji.

(morfologicznie lub metodą izotopową)

4

Metody oparte na precypitacji

1. Co to jest precypitacja- zjawisko wytrącania się kompleksów antygen-przeciwciało

Antygen musi być wielowartościowy! Dochodzi do niej w momencie wyrównania

stężeń między przeciwciałem i antygenem

A. precypitacja probówkowa pierścieniowa
B. immunodyfuzja- proces precypitacji w żelu agarozowym- w strefie

równowagi wytrącają się kompleksy
immunodyfuzja radialna

Immunodyfuzja podwójna

5

C. Immunoelektroforeza- służy identyfikacji mieszaniny różnych białek (np. białek

osocza, immunoglobulin) połączenie metod elektroforezy i immunodyfuzji

Początek- rozdzielenie antygenów (białek) w oparciu o ładunek elektryczny potem

immunodyfuzja pod wpływem znanych surowic przeciw białkom, przeciwciała z
surowic dyfundują w żelu łącząc się z rozdzielonymi elektroforetycznie białkami
badanej surowicy tworząc łuki precypitacyjne.

I przykładowy wynik

C. Nefelometria- powstaj

ą

ce kompleksy tworz

ą

zawiesin

ę

-w nefelometrii

mierzy si

ę

nat

ęż

enia

ś

wiatła rozproszonego przez precypitat, porównuje

6

si

ę

do wzorca-obecnie podstawowa metoda oznaczania immunoglobulin,

sładników dopełniacza i innych białek surowicy!!!!!

Metody oparte o aglutynacj

ę

Co to jest aglutynacja- przeciwciało ł

ą

cz

ą

c si

ę

z nierozpuszczalnym antygenem

pub antygenem opłaszczonym na powierzchni wi

ę

kszych cz

ą

stek (np.

komórek) prowadzi do zlepiania cz

ą

stek i powstawania AGLUTYNATÓW

2 rodzaje:

Aglutynacja bezpo

ś

rednia

- bez no

ś

nika: szkiełkowa i probówkowa

Szkiełkowa- kropla zawiesiny bakteryjnej + kropla surowicy- --je

ż

eli jest reakcja w

surowicy znajduj

ą

si

ę

Ig przeciw antygenowi

Probówkowa- szereg rozciencze

ń

surowicy badanej dodaje si

ę

zawiesin

ę

komó®ek

bakteryjnych i ocenia przy jakim najmniejszym st

ęż

eniu jeszcze aglutynacja .

Przykł

ą

dy: odczyn Widala (diagnostyka Salmonelloz)

Miano surowicy- takie rozcie

ń

czenie surowicy badanej przy którym jeszcze

wyst

ę

puje aglutynacja-metoda półilo

ś

ciowa oznacze

ń

!!!

Typy aglutynacji: - somatyczna
-rz

ę

skowa

- Vi

Aglutynacja po

ś

rednia

– z no

ś

nikiem ( latex albo krwinki)

Reakcja przeciwciał z antygenem opłaszczonym na no

ś

niku- słu

ż

y do wykrywania

przeciwciał- aglutynacja bierna
Je

ż

eli opłaszczymy na no

ś

niku przeciwciała (aglutynacja odwrócona bierna)

metoda b

ę

dzie słu

ż

y

ć

do detekcji antygenów

Je

ż

eli no

ś

nikiem s

ą

krwinki czerwone mówimy o hemaglutynacji

7

Testy Coombsa
Bezpo

ś

redni test Coombsa:

Diagnostyka choroby hemolitycznej noworodków, niedokrwisto

ś

ci

autoimmunohemolitycznych, odczynów potransfuzyjnych-
Oceniamy czy krwinki pacjenta zostały opłaszczone przeciwciałami, dodajemy do
krwinek pobranych od dziecka surowic

ę

z przeciwciałami przeciw fragm. FcIgG-

je

ż

eli dojdzie do hemaglutynacji- to znaczy,

ż

e np. krwinki dziecka Rh- zostały

opłaszczone przeciwciałami anty Rh od matki- dziecko ma chorob

ę

hemolityczn

ą

8

Odczyn po

ś

redni Coombsa

Słu

ż

y do wykrywania przeciwciał anty Rh w krwi matki, ( na tym opiera si

ę

te

ż

próba

krzy

ż

owa przed transfuzj

ą

)

2etapy: 1. erytrocyty wzorcow + badana surowica z Ig anty Rh----opłaszczenie
erytrocytów, 2. dodanie surowicy antyglobulinowej-----aglutynacja,
Matka

Odczyn wi

ą

zania dopełniacza

9

Nie słu

ż

y do oceny dopełniacza!!!!

Służy ocenie obecności badanego antygenu
Etap I
Antygen + Ig + dopełniacz brak antygenu Ig + dopełniacz

Dopełniacz ulega związaniu dopełniacz dalej w surowicy

Etap II

Dodajemy opłaszczone Ig komórki

Brak lizy – bo C związany

liza komórek

WYNIK DODATNI

WYNIK UJEMNY

TESTY ZE ZNACZNIKAMI

1. FLUORYMETRYCZNE
2. RADIOIMMUNOLOGICZNE
3. IMMUNOENZYMATYCZNE
4. CHEMILUMINESCENCYJNE