METODY OCENY AKTYWNOŚCI UKŁADU IMMUNOLOGICZNEGO

1. metody oceny aktywności układu immunologicznego- istotne przy podejrzeniu niedoborów immunologicznych

1.1 OCENA ODPOWIEDZI WRODZONEJ

1.1.1 ocena składowych dopełniacza- immunodyfuzja radialna, ELISA, nefelometria

1.1.2 ocena chemotaksji pod wpływem czynników andogennych (C3a,C5a, IL8) i egzogennych (endotoksyny, zymosan)

- metoda „agarozowa” mierzy się na jaką odległość komórki ”odejdą” w podłożu agarozowym od środkowej studzienki w kierunku czynnika chemotaktycznego

- metoda „filtrowa” Boydena”- podzielona komora za pomoca filtra miliporowego- (pory mniejsze od średnicy badanych komórek), w jednej komorze badane komórki w drugiej roztwór czynnika chemotaktycznego- badamy indeks chemotaktyczny- stosunek komórek które przeszły w obecności czynnika chemotaktycznego w porównaniu do liczby komórek które przeszły przez filtr kontrolny.

1..1.3 badanie zdolności fagocytarnych-

- metoda probówkowa- Drobnoustroje +zawiesina fagocytów---inkubacja-----rozmazy na szkiełkach -liczymy

- metoda jednowarstwowa- ( od początku na szkiełku) opsonizowane bakterie + fagocyty—inkubacja—odczyt ( drobnoustroje mogą być znakowane fluorochromami- wtedy odczyt w mikroskopie fluorescencyjnym)

1..1.4 badanie aktywności metabolicznej wewnątrzkomórkowej komórek:

A. test NBT,

B. pomiar zdolności wzbudzania chemiluminescencji

C. zdolnośc do redukcji cytochromu C

A. Co ocenia? zdolności generacji rodników ponadtlenkowych przez neutrofile . test NBT test pochłaniania i redukcji NBT (błękitu nitrotetrazolinowego)

NADH i NADPH wytwarzane w trakcie wybuchu tlenowego w fagocytach mają zdolność redukcji związku NBT do formazanu (błękitne złogi)

Neutrofile inkubuje się z NBT-----odczyt ile % komórek jest NBT + (norma 8%) podwyższone wartości - aktualna infekcja, obniżone wartości- przewlekła ch. Ziarniniakowata, toczeń, pacjenci leczeni sterydami

1. ODPOWIEDŹ HUMORALNA

1. Oznaczanie poziomu przeciwciał w surowicy i ich podklas

2. ODPWOIEDŹ KOMÓRKOWA

- ocena fenotypu limfocytów

- metody oceny zdolności limfocytów do aktywacji

Test transformacji blastycznej

Izolowane limfocyty ---hodowla z miogenami (laktynami)

Równolegle hodowla bez czynnika mitotycznego

Po inkubacji kilkudniowej ocenia się liczbę komórek ulegających transformacji. (morfologicznie lub metodą izotopową)

Metody oparte na precypitacji

1. Co to jest precypitacja- zjawisko wytrącania się kompleksów antygen-przeciwciało

Antygen musi być wielowartościowy! Dochodzi do niej w momencie wyrównania stężeń między przeciwciałem i antygenem

1. precypitacja probówkowa pierścieniowa

2. immunodyfuzja- proces precypitacji w żelu agarozowym- w strefie równowagi wytrącają się kompleksy

immunodyfuzja radialna

Immunodyfuzja podwójna

C. Immunoelektroforeza- służy identyfikacji mieszaniny różnych białek (np. białek osocza, immunoglobulin) połączenie metod elektroforezy i immunodyfuzji

Początek- rozdzielenie antygenów (białek) w oparciu o ładunek elektryczny potem immunodyfuzja pod wpływem znanych surowic przeciw białkom, przeciwciała z surowic dyfundują w żelu łącząc się z rozdzielonymi elektroforetycznie białkami badanej surowicy tworząc łuki precypitacyjne.

I przykładowy wynik

3. Nefelometria- powstające kompleksy tworzą zawiesinę-w nefelometrii mierzy się natężenia światła rozproszonego przez precypitat, porównuje się do wzorca-obecnie podstawowa metoda oznaczania immunoglobulin, sładników dopełniacza i innych białek surowicy!!!!!

Metody oparte o aglutynację

Co to jest aglutynacja- przeciwciało łącząc się z nierozpuszczalnym antygenem pub antygenem opłaszczonym na powierzchni większych cząstek (np. komórek) prowadzi do zlepiania cząstek i powstawania AGLUTYNATÓW

• rodzaje:

Aglutynacja bezpośrednia- bez nośnika: szkiełkowa i probówkowa

Szkiełkowa- kropla zawiesiny bakteryjnej + kropla surowicy- --jeżeli jest reakcja w surowicy znajdują się Ig przeciw antygenowi

Probówkowa- szereg rozcienczeń surowicy badanej dodaje się zawiesinę komó®ek bakteryjnych i ocenia przy jakim najmniejszym stężeniu jeszcze aglutynacja . Przykłądy: odczyn Widala (diagnostyka Salmonelloz)

Miano surowicy- takie rozcieńczenie surowicy badanej przy którym jeszcze występuje aglutynacja-metoda półilościowa oznaczeń!!!

Typy aglutynacji: - somatyczna

-rzęskowa

- Vi

Aglutynacja pośrednia - z nośnikiem ( latex albo krwinki)

Reakcja przeciwciał z antygenem opłaszczonym na nośniku- służy do wykrywania przeciwciał- aglutynacja bierna

Jeżeli opłaszczymy na nośniku przeciwciała (aglutynacja odwrócona bierna) metoda będzie służyć do detekcji antygenów

Jeżeli nośnikiem są krwinki czerwone mówimy o hemaglutynacji

Testy Coombsa

Bezpośredni test Coombsa:

Diagnostyka choroby hemolitycznej noworodków, niedokrwistości autoimmunohemolitycznych, odczynów potransfuzyjnych-

Oceniamy czy krwinki pacjenta zostały opłaszczone przeciwciałami, dodajemy do krwinek pobranych od dziecka surowicę z przeciwciałami przeciw fragm. FcIgG-jeżeli dojdzie do hemaglutynacji- to znaczy, że np. krwinki dziecka Rh- zostały opłaszczone przeciwciałami anty Rh od matki- dziecko ma chorobę hemolityczną

Odczyn pośredni Coombsa

Służy do wykrywania przeciwciał anty Rh w krwi matki, ( na tym opiera się też próba krzyżowa przed transfuzją)

2etapy: 1. erytrocyty wzorcow + badana surowica z Ig anty Rh----opłaszczenie erytrocytów, 2. dodanie surowicy antyglobulinowej-----aglutynacja,

Matka

Odczyn wiązania dopełniacza

Nie służy do oceny dopełniacza!!!!

Służy ocenie obecności badanego antygenu

Etap I

Antygen + Ig + dopełniacz brak antygenu Ig + dopełniacz

Dopełniacz ulega związaniu dopełniacz dalej w surowicy

Etap II

Dodajemy opłaszczone Ig komórki

Brak lizy - bo C związany liza komórek

WYNIK DODATNI WYNIK UJEMNY

TESTY ZE ZNACZNIKAMI

1. FLUORYMETRYCZNE

2. RADIOIMMUNOLOGICZNE

3. IMMUNOENZYMATYCZNE

4. CHEMILUMINESCENCYJNE

9

---