Ćwiczenie 4
Rozpuszczalność, wysalanie i denaturacja białek
WyciÄ…g z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
" Kwas octowy  C
" Kwas azotowy (V)  C
" Kwas solny  C
" Kwas trichlorooctowy  C, N
" Kwas 5-sulfosalicylowy 2 hydrat  C
" Kwas pikrynowy  F, T
" Kwas fosfowolframowy hydrat  C
" Wodorotlenek sodu  C
" nadsiarczan amonu  O, Xn
" Etanol 96%  F
" Miedzi (II) siarczan kryst. 5 hydrat  Xn, N
" OÅ‚owiu (II) octan 3 hydrat  T, N
" Rtęci (II) chlorek  T+, N
" śelaza chlorek bezwodny  Xn
I. Rozpuszczalność i wysalanie białek
Niektóre białka dobrze rozpuszczają się w wodzie, inne natomiast rozpuszczają się dopiero w rozcieńczonych
roztworach soli. Stąd dzieli się je na białka hydrofilowe, o du\
ym oraz hydrofobowe, o małym powinowactwie do
wody. O rozpuszczalności białek decyduje przede wszystkim ich powinowactwo do wody tj. zdolność do
hydratacji. Woda wiązana jest przez białko poprzez atomy tlenu i azotu wiązania peptydowego (wiązanie
koordynacyjne) oraz grupy hydrofilowe łańcuchów bocznych aminokwasów poprzez wiązania wodorowe lub
siłami oddziaływań typu dipol-dipol (oddziaływania van der Waalsa). W konsekwencji cząsteczki białek
hydrofilowych otoczone są płaszczem wodnym (woda hydratacyjna), który stanowi znaczącą i nieodłączną część
cząsteczki białka (30-40%) i ma istotny wpływ na jej właściwości strukturalne (czyli na wymiary i kształt
cząsteczki białka) oraz funkcjonalne (dostępność ró\
nych ugrupowań powierzchniowych, osłabianie reaktywności
maskowanych przez nią grup). Białka hydrofilowe mogą czasem wiązać drobiny wody równie\
wewnątrz własnej
cząsteczki na skutek obecności tam reszt aminokwasów polarnych, czemu towarzyszy zwiększanie objętości
cząsteczek białka określane mianem pęcznienia. Na rozpuszczalność białek wpływa te\
pH roztworu i obecność
w nim soli. Rozpuszczalność białka w roztworze o pH zbli\
onym do jego punktu izoelektrycznego (pI) jest
niewielka. Czynniki zwiększające rozpuszczalność białka utrudniają jego wytrącanie, a związki obni\
ajÄ…ce
rozpuszczalność powodują wytrącenie osadu białka po osiągnięciu pI. Białka hydrofobowe są rozpuszczalne
tylko w roztworach elektrolitów na skutek selektywnej adsorpcji z roztworu jonów jednego rodzaju, co powoduje,
\
e białka te posiadają ten sam ładunek elektryczny a przez to utrzymują się w roztworze. Rozpuszczalność białek
hydrofilowych wynika natomiast z wytwarzania warstwy hydratacyjnej i jednakowego Å‚adunku czÄ…steczek samego
białek, którego z
ródłem jest dysocjacja kwasowych i zasadowych grup obecnych w cząsteczkach tych białek.
1. Rozpuszczalność globulin w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli
Zasada:
Globuliny są białkami nierozpuszczalnymi w wodzie z powodu silnego momentu dipolowego (tworzenie
agregatów). Kationy oraz aniony soli nieorganicznych dzięki zobojętnianiu dodatnich i ujemnych ładunków dipola
1
białkowego (zjonizowanych grup) odpowiedzialnych za przyciąganie pomiędzy cząsteczkami białka, zapobiegają
agregacji cząsteczek białek. Powinowactwo jonów do tych zjonizowanych grup jest bowiem większe od
powinowactwa dwubiegunowych cząsteczek wody. Albuminy dzięki temu, \
e ich momenty dipolowy jest mniejszy
od momentu dipolowego globulin oraz właściwemu sobie du\
o większemu powinowactwu do wody, są dobrze
rozpuszczalne w wodzie.
Wykonanie:
A. Zmieszać 0,5 ml surowicy z 12,5 ml wody i odstawić na kilka minut. Pojawia się zmętnienie roztworu od
wytrąconych globulin, które znika po dodaniu kilku kropli nasyconego roztworu NaCl.
B. Jeden gram mączki grochowej ekstrahować 25 ml 0,9% roztworu NaCl. Osad odwirować, a porcję
supernatantu (1 ml) rozcieńczać stopniowo wodą obserwując zwiększanie się zmętnienia z powodu wytrącania
się globulin. Po dodaniu kilku kropli nasyconego roztworu NaCl osad ponownie się rozpuści.
2. Wpływ pH na rozpuszczalność białek
Zasada:
Rozpuszczalność ka\
dej substancji jest wynikiem równowa\
enia wewnętrznych sił przyciągania cząsteczek ciała
rozpuszczanego i przyciągania pomiędzy cząsteczkami rozpuszczalnika a cząsteczkami ciała rozpuszczanego.
W punkcie izoelektrycznym przyciąganie pomiędzy cząsteczkami białka jest największe, gdy\
nie posiadajÄ… one
ładunku elektrycznego, a więc białko w pI jest najsłabiej rozpuszczalne, gdy\
cząsteczki białka zbijają się
w agregaty łatwo wypadające z roztworu. W pH ró\
nym od pI białka są obdarzone ładunkiem, co zmniejsza
wzajemne przyciąganie jego cząsteczek, a w efekcie zwiększa rozpuszczalność.
Wykonanie:
Do 0,25 ml surowicy dodać 0,5 ml wody i wprowadzać kroplami roztwór 10 M HCl tak długo jak narasta
zmętnienie roztworu (ok. 0.25 ml). Dodawać następnie kroplami roztwór nasyconego NaOH a\
do ponownego
rozpuszczenia osadu.
3. WytrÄ…canie albumin i globulin etanolem
Zasada:
W roztworach o pH bliskim wartości 5, globuliny wytrącają się przy stę\
eniu etanolu równym 15%, a albuminy
przy stÄ™\
eniu równym 40%. Przy innych wartościach pH konieczne jest stosowanie wy\
szych stÄ™\
eń etanolu.
Etanol powoduje odwodnienie białka i jego wypadanie z roztworu, ale jeśli czynnik ten działa krótko i w niskich
temperaturach to mo\
na je ponownie rozpuścić. Białka wytrącane w niskich temperaturach etanolem
(-5°C do -15°C) nie ulegajÄ… denaturacji, co wykorzystuje siÄ™ do otrzymywania frakcji biaÅ‚ek surowicy metodÄ…
Cohna.
Wykonanie:
A. 0,5 ml surowicy 2-krotnie rozcieÅ„czonej 0,9% roztworem NaCl oziÄ™bić do 0°C. NastÄ™pnie dodać 0,5 ml 95%
etanolu. Występuje zmętnienie, które znika po natychmiastowym rozcieńczeniu wodą.
B. Do 0,5 ml 5-krotnie rozcieńczonej surowicy 0,9% roztworem NaCl dodać 1 ml 95% etanolu. Wytrąca się osad
rozpuszczalny w wodzie.
4. Wysalanie białek silnymi elektrolitami
Sole obojętne w sposób charakterystyczny wpływają na rozpuszczalność białek. Przy mniejszych stę\
eniach
zwiększają rozpuszczalność białek, a przy większych stę\
eniach powodują wypadanie białek w postaci
nierozpuszczalnych osadów. Spowodowane jest to odciąganiem cząsteczek wody od cząsteczek białka przez
jony soli z powodu konkurowania z białkami o cząsteczki wody, co w konsekwencji zmniejsza rozpuszczalność
białka, a przy du\
ych stÄ™\
eniach soli powoduje wypadanie białek z roztworu, czyli tak zwane wysalanie białek.
Wysalanie białek jest procesem odwracalnym, gdy\
dodanie czystego rozpuszczalnika lub obni\
enie stÄ™\
enia soli
przez dializę powoduje ponowne rozpuszczenie białek. Ró\
ne białka wymagają do wysolenia ró\
nych stÄ™\
eń soli
i własność ta jest wykorzystywana do rozdzielania mieszanin białkowych. Najbardziej skutecznym związkiem
wysalającym białka jest nadsiarczan amonu [(NH ) SO ] ze względu na du\
ą własną rozpuszczalność tej soli,
4 2 4
2
przez co mo\
na uzyskać roztwory o du\
ej sile jonowej. Białka wytrącane siarczanem amonu, sodu lub magnezu
nie ulegają denaturacji, więc po obni\
eniu stÄ™\
enia soli (np. przez dializę) otrzymuje się roztwór białka o pełnej
aktywności biologicznej.
4.1. Oddzielanie albumin od globulin
Zasada:
Osocze jest mieszaniną białek o ró\
nej masie cząsteczkowej i ró\
nym stopniu uwodnienia. Poszczególne frakcje
osocza mo\
na łatwo oddzielać wykorzystując ich ró\
ną rozpuszczalność w stę\
onych roztworach soli. Najłatwiej,
ju\
przy 25% nasyceniu roztworu (NH ) SO wysala siÄ™ fibrynogen. Globuliny tracÄ… wodÄ™ hydratacyjnÄ… przy 50%
4 2 4
nasyceniu roztworu (NH ) SO lub w nasyconych roztworach MgSO i Na SO . Albuminy wysalajÄ… siÄ™ natomiast
4 2 4 4 2 4
dopiero po całkowitym wysyceniu roztworu (NH ) SO .
4 2 4
Wykonanie:
Do 0,5 ml surowicy 2-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl dodać taką samą objętość nasyconego
roztworu (NH ) SO . Po zmieszaniu uzyskuje się pół-nasycenie roztworu siarczanu amonu. Wytrącający się
4 2 4
kłaczkowaty osad globulin odwirować (1 min), a do klarownego supernatantu dodawać (NH ) SO in substantia,
4 2 4
a\
do nasycenia roztworu i zaobserwowania wytrÄ…cania albumin.
II. Denaturacja białek
Termin denaturacja białek oznacza naruszenie lub zniszczenie natywnej konformacji białka, co zawsze pociąga
za sobą zmianę lub utratę jego biologicznych aktywności (np. enzymatycznych, hormonalnych, antygenowych),
a nawet mo\
e być przyczyną zmian jego właściwości fizykochemicznych (zmniejszenie rozpuszczalności, wzrost
lepkości, utrata skręcalności światła spolaryzowanego). Denaturacja jest procesem samorzutnym,
egzoergicznym, a przez to nieodwracalnym. Po denaturacji białka mają zwykle właściwości hydrofobowe,
niezale\
ne od typu natywnego białka, hydrofilowego czy hydrofobowego. Białka zdenaturowane w pH ró\
nym od
pI (czyli w formie jonu) utrzymujÄ… siÄ™ w roztworze, gdy\
stabilizuje je Å‚adunek elektryczny, a podczas denaturacji
białka w pI natychmiast ulegają wytrąceniu z roztworu (koagulacji).
Denaturację białek mogą powodować niektóre czynniki fizyczne takie jak: wysoka temperatura,
ultradz
więki, promieniowanie X i ultrafioletowe, wstrząsanie wodnych roztworów białka w atmosferze powietrza,
wysychanie. Czynnikami chemicznymi denaturującymi białka są: stę\
one kwasy i zasady nieorganiczne, kationy
metali ciÄ™\
kich, niektóre kwasy organiczne, stosowanie rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą
(etanol, aceton) w temperaturze pokojowej, chlorowodorek guanidyny, mocznik, detergenty (siarczan dodecylu
sodu, Triton), fenol, chloroform. Czynniki denaturujące działają na wiązania stabilizujące strukturę przestrzenną
białka (wiązania wodorowe, wiązania jonowe, oddziaływania hydrofobowe, wiązania dwusiarczkowe, wiązania
koordynacyjne), a przez to powodują zniekształcenie lub zniszczenie struktury II-, III- czy IV-rzędowej, bez
hydrolitycznej degradacji łańcucha polipeptydowego.
1. Denaturacja cieplna
Zasada:
Ciepło powodując rozrywanie wiązań wodorowych w cząsteczkach, nieodwracalnie denaturuje białka. Dla
ró\
nych białek proces ich denaturacji cieplnej rozpoczyna się w ró\
nych temperaturach (pomiÄ™dzy 40°C
a 100°C), a tylko nieliczne biaÅ‚ka wytrzymujÄ… krótkotrwaÅ‚e gotowanie (np. \
elatyna, rybonukleaza). Większość
białek globularnych wykazuje najmniejszą rozpuszczalność blisko punktu pI danego białka. Przy pH
odpowiadającym pI cząsteczki, białka są elektrycznie obojętne, przez co wykazują tendencję do agregacji, co
powoduje ich wypadanie z roztworu.
Wykonanie:
Do 0,5 ml surowicy 5-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl dodać jedną kroplę 1% roztworu CH COOH
3
i ogrzewać do wrzenia. Powstaje wówczas obfity osad białka zdenaturowanego przez ogrzewanie. Kwas octowy
3
sprowadza odczyn roztworu do pH około 5, tj. takiej wartości pH, w której większość białek jest nierozpuszczalna.
Powstały biały kłaczkowaty osad po dodaniu NaCl lub MgSO stanie się wyraz
niejszy. Dlaczego?
4
2. Działanie rozpuszczalników organicznych
Zasada:
Rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, aceton) stosowane przez dłu\
szy czas w większych stę\
eniach
i w wy\
szej temperaturze (20°C  30°C) dezorganizujÄ…c warstwÄ™ wodnÄ… otaczajÄ…cÄ… czÄ…steczki biaÅ‚ka
i osłabiając ich oddziaływania hydrofilowe, umo\
liwiają wzajemne łączenie się cząsteczek białka, a przez to
powodują wytrącanie zdenaturowanych białek z roztworów.
Wykonanie:
Do 0,5 ml surowicy rozcieńczonej 5-krotnie 0,9% roztworem NaCl dodać 1 ml 95% etanolu. Po godzinie
zawartość probówki rozcieńczyć wodą. Strąt nie rozpuszcza się. Porównaj z ćwiczeniem Wytrącanie białek
etanolem.
3. Działanie stę\
onego HNO . Odczyn Hellera
3
Wykonanie:
Na pół ml stę\
onego HNO ostro\
nie nawarstwić 0,5 ml surowicy 5-krotnie rozcieńczonej 0,9% NaCl, tak aby
3
płyny się nie mieszały. Na granicy zetknięcia roztworów powstaje biały pierścień zdenaturowanego i wytrąconego
białka. Pierścień ten jest nierozpuszczalny w nadmiarze kwasu.
4. Działanie NaOH
Zasada:
StÄ™\
one zasady nieorganiczne powodują denaturację białka, ale większość z nich pozostaje w stanie
rozpuszczonym w środowisku zasadowym. Zdenaturowane białko ulega wytrąceniu po zobojętnieniu roztworu.
Wykonanie:
A. Do 0,5 ml surowicy dodać 0,25 ml 2 M roztworu NaOH. Po wymieszaniu dodawać kroplami 5% roztwór
CH COOH a\
do momentu wytworzenia delikatnego osadu.
3
B. Do 1 ml surowicy dodać parę kropli 2 M roztworu NaOH, wymieszać i następnie dodawać kroplami
rozcieńczony CH COOH a\
do momentu utworzenia kłaczkowatego osadu.
3
5. Działanie kationów metali cię\
kich na białka
Zasada:
Białka w pH wy\
szym od punktu izoelektrycznego posiadają ładunek ujemny, więc mogą reagować z kationami.
Białczany, czyli sole metali cię\
kich (Fe+2, Fe+3, Hg+2, Pb+2) z białkami mają małe wartości stałych dysocjacji,
przez co są trudno rozpuszczalne i wypadają z roztworu w formie nierozpuszczalnych kompleksów. Z tego
powodu jony metali ciÄ™\
kich np. rtęci, ołowiu, miedzi są wykorzystywane do wytrącania białek z roztworu.
Wykonanie:
Przygotować trzy probówki z 0,5 ml surowicy 5-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl. Dodawać do nich
kroplami za ka\
dym razem wstrząsając: do pierwszej  1% roztwór CuSO , do drugiej  1% roztwór
4
(CH COO) Pb, a do trzeciej  5% roztwór HgCl . Do czwartej probówki dodać 0,5 ml surowicy 2-krotnie
3 2 2
rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl i kilka kropli 1% roztworu FeCl . Obserwować wytrącanie białka.
3
6. Wytrącanie białek anionami
Zasada:
W roztworach poni\
ej punktu izoelektrycznego grupy aminowe białka ulegają protonowaniu, więc białka
obdarzone są ładunkiem dodatnim. Niektóre kwasy organiczne np. kwas trichlorooctowy (CCl COOH),
3
sulfosalicylowy, pikrynowy i fosfowolframowy, tworzą z nimi nierozpuszczalne połączenia. Białka w obecności
4
powy\
szych związków ulegają denaturacji i kwasy te wykorzystuje się do odbiałczania roztworów. Odbiałczanie
roztworów jest konieczne przy oznaczaniu w nich stę\
enia niektórych niskocząsteczkowych związków (np.
mleczanu czy pirogronianu w surowicy krwi), gdy\
pozwala uniknąć reakcji jakie mogłyby dawać białka
z odczynnikami stosowanymi do ilościowego oznaczania określonego związku.
Wykonanie:
Przygotować cztery probówki zawierające po 0,5 ml surowicy 10-krotnie rozcieńczonej 0,9% roztworem NaCl. Do
pierwszej dodać 0,5 ml 10% roztworu kwasu trichlorooctowego, do drugiej  kilka kropli 20% roztworu kwasu
sulfosalicylowego, do trzeciej  3 krople 5% roztworu CH COOH i 100-200 µl kwasu pikrynowego, a do czwartej
3
 0,5 ml 5% roztworu kwasu fosfowolframowego. Obserwować wytrącanie białka.
Odczynniki
surowica bydlęca, mączka grochowa
nasycony roztwór NaCl, 0,9% roztwór NaCl, NaCl in substantia, nasycony roztwór NaOH, 2 M roztwór NaOH,
nasycony roztwór (NH ) SO , (NH ) SO in substantia, 1% roztwór CuSO , 1% roztwór (CH COO) Pb,
4 2 4, 4 2 4 4 3 2
5% roztwór HgCl , 1% roztwór FeCl , 95% etanol
2 3
stÄ™\
HNO , 10 M roztwór HCl, 1% roztwór CH COOH, 5% roztwór CH COOH, 10% roztwór kwasu
3 3 3
trichlorooctowego, 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego, 5% roztwór kwasu fosfowolframowego, kwas
pikrynowy
5