Współczesne metody badania enzymów:
•
Dichroizm kołowy:
•
Służy do badania struktury drugorzędowej białek
•
Większość cząsteczek jest asymetryczna – gdy absorbują światło, wykazują preferencje w stosunku do absorpcji, w prawo lub w lewo, kołowo spolaryzowanego światła
•
Badania w podczerwieni:
•
Są stosowane do badania konformacji cząsteczek białek
•
Białka i kwasy nukleinowe wykazują wiele rodzajów molekularnych wibracji i oscylacji
•
Określone pozycje pasm podczerwieni odpowiadające wibracjom w szkielecie polipeptydowym są czułe na konformacyjną formację cząsteczki
•
Widmo Ramana:
•
Służy do analizy jakościowej i ilościowej mieszanin i określania struktury cząsteczek
•
To rozpraszanie światła połączone ze zmianą jego częstości
•
Występują linie widma Ramana - ich liczba i położenie zależą od budowy cząsteczek substancji rozpraszającej
•
Site-directed mutagenesis, deletional mutagenesis:
•
Manipulując sekwencją aminokwasową można zidentyfikować grupy chemiczne biorące udział w wiązaniu ligandów i etapach katalizy
•
Jeśli np. interesująca nas seryna jest kodowana przez kodon TCT, to należy zmienić C na G
żeby uzyskać kodon cysteinowy TGT
•
NMR (spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego):
•
Umożliwia badania struktur przestrzennych białek i ich dynamiki w roztworze
•
Opiera się na zjawisku rezonansu między stanami spinowych poziomów energetycznych, a zewnętrznym polem magnetycznym
•
Sposób oddziaływania spinów sąsiadujących ze sobą jąder daje informacje o strukturze białek
•
Spektrometria mas:
•
Pozwala na analizę zjonizowanych form cząsteczek w fazie gazowej
•
Pomiar masy cząsteczkowej odbywa się przez wyznaczenie przyśpieszenia uzyskanego przez jony w polu elektrycznym
Działanie enzymów:
•
Zwiększają szybkość reakcji 1012 razy w porównaniu z reakcją niekatalizowaną
•
Wynika to z ustawienia obok siebie grup reaktywnych w miejscu aktywnym enzymu w taki sposób, że ułatwiają etapy reakcji prowadzące do powstania produktu
Orbitale atomowe:
•
Wiązania chemiczne w cząsteczkach są pochodnymi wiązań między atomami, a ściślej – między orbitalami poszczególnych atomów, których oddziaływania tworzą orbitale molekularne
•
Elektrony wypełniają te orbitale zgodnie z energią potencjalną przypisaną danemu orbitalowi –
orbitale o niższej energi zostają wypełnione najpierw, po nich następuje wypełnianie orbitali o energi wyższej
•
Dla każdego z atomów pierwiastków biogennych elektrony na najwyższych poziomach energetycznych orbitali s i p są zdolne do udziału w reakcjach chemicznych – są to elektrony walencyjne
Orbitale molekularne:
Jeśli dwa atomy znajdą się w bliskiej odległości od siebie i jeśli ich orbitale walencyjne mają odpowiednią energię i symetrię, to dwa walencyjne orbitale atomowe (każdy z jednego atomu) mogą połączyć się (elektrony stają się wspólne dla obu jąder – tworzy się wiązanie), by utworzyć dwa orbitale molekularne (wiążący σ i antywiążący σ*)
Orbital wiążący ma niższą energię niż oryginalne dwa orbitale atomowe, dlatego zajmowanie miejsca na tym orbitalu promuje wiązanie między atomami w celu stabilizacji systemu (cząsteczki)
Orbital antywiążący ma wyższą energię niż oryginalne orbitale atomowe – destabilizacja cząsteczki Orbitale zhybrydyzowane:
•
W atomach C, N i O orbitale 2s i 2p mają podobne wartości energi , co powoduje że mogą oddziaływać tak, żeby utworzyć orbitale o charakterze mieszanym (sp)
•
Te orbitale hybrydowe pozwalają na utworzenie maksymalnej liczby wiązań jaką może utworzyć atom, jednocześnie utrzymując największy dystans między wiązaniami, co pozwala na minimalizację sił odpychających
Możliwe są trzy typy hybrydyzacji:
•
sp, gdy orbital 2s łączy się z orbitalem 2p (kąt między wiązaniami – 180°)
•
sp2, gdy orbital 2s łączy się z 2 orbitalami 2p – pozwala to na utworzenie trzech wiązań leżących w płaszczyźnie trójkąta (kąt między wiązaniami – 120°)
•
sp3, gdy orbital 2s łączy się z 3 orbitalami 2p – daje to możliwość 4 wiązań σ, które leżą wzdłuż wierzchołków czworościanu (kąt między wiązaniami – 109°)
Termodynamika reakcji chemicznych:
•
Pierwsza – zasada zachowania energii:
•
W każdym procesie całkowita ilość energi systemu wraz z otoczeniem pozostaje stała
•
Chociaż energia ani nie powstaje ani nie ulega zniszczeniu w danym procesie, to mogą zachodzić transformacje jednej jej formy w inną (na przykład energia chemiczna może być zamieniana w energię cieplną, radiacyjną, elektryczną lub mechaniczną)
•
Druga – we wszystkich procesach entropia (nieuporządkowanie) systemu wraz z otoczeniem zwiększa się aż do osiągnięcia równowagi w punkcie w którym entropia jest największa w danych warunkach ciśnienia i temperatury
•
Energia swobodna Gibbsa (G): ta forma energi jest zdolna do wykonania pracy w stałej temperaturze i ciśnieniu, jakie są np. w komórce
Stan przejściowy reakcji chemicznych:
•
Taka forma molekularna, która ma stare wiązania i nowe częściowo uformowane – jest to stan, w którym stare i nowe wiązania są jednocześnie rozrywane i tworzone
•
Reprezentuje barierę energetyczną, która musi zostać pokonana, żeby reakcja mogła przebiegać dalej
Energia aktywacji:
•
Energia potrzebna do osiągnięcia stanu aktywacji:
•
Różnica energi swobodnej między stanem reagentów a stanem przejściowym
•
Wielkość energi aktywacji jest bezpośrednio powiązana z szybkością reakcji chemicznej – w miarę jak rośnie energia aktywacji, szybkość reakcji spada wykładniczo
Strukturalne składniki enzymów:
•
Aminokwasy:
•
Hydrofilowość – Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg
•
Aromatyczność – His, Phe, Tyr, Trp
•
Zawierające siarkę – Cys, Met
•
Inne – Pro
•
Donorami protonów dla wiązania wodorowego są: Tyr, Ser, Thr, Trp, His, Cys, w niskim pH
łańcuchy boczne Glu i Asp
•
Akceptorami wiązania wodorowego mogą być: Tyr, Glu, Asp, Ser, Thr, His, Cys, Met
•
Oddziaływania elektrostatyczne - zachodzą między ujemnie i dodatnio naładowanymi aminokwasami w białkach
•
Łańcuchy boczne aminokwasów mogą brać udział w reakcjach elektrofilowego i nukleofilowego podstawienia w cząsteczkach substratu, co prowadzi do powstawania i rozkładu wiązań
•
Ustawienie grup kwasowych i zasadowych w pozycjach istotnych dla katalizy w centrum aktywnym enzymu jest powszechnym mechanizmem wykorzystywanym przez enzymy dla ułatwienia szybkich reakcji chemicznych z cząsteczkami wiążącymi się w centrum aktywnym
•
Modyfikacje łańcuchów bocznych mają krytyczne znaczenie dla mechanizmu katalitycznego enzymów:
•
Tworzenie wiązań siarczkowych
•
Fosforylacje
•
Glikozylacje
•
Upakowanie łańcuchów bocznych aminokwasów w centrum aktywnym enzymu daje ogólny kształt i rozmiar kieszeni, do czego przystosowuje się cząsteczka substratu
Jony metali (Fe, Cu, Ni, Co):
•
Domeny białek wiążących kwasy nukleinowe zawierają palce cynkowe, cynk jest centrum strukturalnym insuliny, a kalmodulina wiąże jony wapnia
•
Metale biorą udział w reakcjach chemicznych katalizowanych przez enzym
•
Stanowią centra redox (hem-Fe, żelazo niehemowe, Cu)
•
Prawoskrętna helisa:
•
Jest stabilizowana przez wiązania wodorowe między tlenem karbonylowym jednej reszty (i) a protonem azotu
•
Wiązania wodorowe są możliwe z powodu ułożenia grup C=O i N–H wzdłuż osi helisy
•
Struktura β-kartki:
•
Przedstawia w pełni rozciągnięte łańcuchy polipeptydowe połączone wiązaniami wodorowymi między sobą:
•
Ustawienie wiązań C=O i N–H pozwala na dokładanie łańcuchów polipeptydowych z lewej i z prawej strony konstrukcji
•
Zwrot β:
•
Są to krótkie segmenty łańcuchów polipeptydowych, co pozwala na zmianę kierunku – obrót wokół siebie
•
Zwroty β składają się z 4 reszt aminokwasowych w zwartej konfiguracji, w której interamidowe wiązanie wodorowe tworzy się między pierwszą i czwartą resztą, co stabilizuje strukturę
•
Odgrywa znaczącą rolę dla trójwymiarowej struktury białka
Stuktura trzeciorzędowa:
•
Fałdowanie takie zbliża odległe aminokwasy, co pozwala na utworzenie reaktywnych chemicznie centrów, jak centra aktywne enzymów
•
Trzeciorzędowa struktura białka pozwala na tworzenie fałdów i kieszeni, które mieszczą małe cząsteczki, i dyktuje ich formację przestrzenną
Centrum aktywne:
•
Wiązanie cząsteczki substratu
•
Doprowadzenie do bliskiego sąsiedztwa chemicznie reaktywnych grup, co ułatwi przemianę substratów w produkty katalizowanej reakcji
•
Zajmuje tylko niewielką część molekuły
•
Aminokwasy i kofaktory w centrum aktywnym są precyzyjnie utrzymywane
•
W większości wypadków wiązanie substratu z enzymem zachodzi przy pomocy wiązań niekowalencyjnych
•
Mieści się zwykle w bruzdach i szczelinach cząsteczki białka - jest ono praktycznie izolowane od rozpuszczalnika, który zmniejszałby aktywność enzymatyczną enzymu
E + S -> ES -> ES* -> EP -> E + P
Reakcja enzymatyczna:
1. Enzym i substrat muszą się zetknąć (poprzez molekularne kolizje w roztworze), żeby utworzyć kompleks ES
2. Po związaniu substratu, struktura centrum aktywnego ułatwia tworzenie stanu przejściowego 3. Kompleks ES++ może powrócić do struktury ES lub przekształcić się w EP
4. Jeśli został uformowany, kompleks EP musi ostatecznie zdysocjować prowadząc do uwolnienia produktu i wolnego enzymu obecnego na starcie reakcji
•
Enzym nie zmienia równowagi między produktami i substratami
Działanie enzymów:
•
Wiele reakcji niekatalizowanych przebiega zbyt wolno, bo muszą pokonać dużą barierę energetyczną, aby osiągnąć stan przejściowy
•
Jeśli jakimś sposobem bariera ta zostanie obniżona przez stabilizację stanu przejściowego to reakcja będzie przebiegać szybciej
Mechanizmy działające w centrum aktywnym:
•
Siły wewnątrz centrum aktywnego enzymu mogą powodować ustawienie grup reaktywnych enzymu i cząsteczki substratu we właściwej orientacji dla przebiegu reakcji
•
Wiązania wodorowe, elektrostatyczne, hydrofobowe i van der Vaalsa mogą odkształcać cząsteczkę substratu w kierunku stanu przejściowego
•
Interakcje w miejscu aktywnym mogą powodować perturbacje orbitali molekularnych substratu, przez ułożenie ich w jednej lini z grupami reaktywnymi
•
Jest głównie determinowana przez stopnie swobody ruchu rotacyjnego i ruchu przez przeniesienie
•
Jest miarą stopnia nieuporządkowania układu
Modele kompleksu enzym-substrat:
•
Model Koshlanda - oparty na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu i przekształceniu ich w produkty
•
Model zamka i klucza - enzym musi być dopasowany swoim kształtem do substratu, by móc przekształcić go w produkt.
•
Model trzypunktowego przyłączenia - do specyficznego związania substratu przez enzym wystarczą tylko trzy miejsca wiązania
•
Model indukowania molekularnych napięć - grupy boczne aminokwasów je tworzące podlegają rearanżacjom przestrzennym, ściśle dopasowując swe pozycje do wiązanego substratu, co dopiero umożliwia przeprowadzenie katalizy
Rodzaje enzymów:
1. Oksydoreduktazy – reakcje red-ox
2. Transferazy – przenoszenie grup chemicznych
3. Hydrolazy – hydrolityczne rozerwanie wiązań
4. Liazy – niehydrolityczne rozerwanie wiązań
5. Izomerazy – zmiany w ustawieniu atomów i cząsteczek
6. Ligazy – łączenie 2 lub więcej cząsteczek razem
Kataliza rozpadu wiązania peptydowego:
•
Proteazy serynowe - enzymy, które katalizują rozpad wiązań peptydowych w peptydach i białkach
•
Reszta serynowa działa jako główny nukleofil do ataku nukleofilowego na wiązanie peptydowe
•
Nukleofilowość seryny potęgują interakcje z łańcuchem bocznym histydyny, która oddziałuje z łańcuchem bocznym asparaginy
•
Proteazy serynowe pełnią rolę nie tylko w procesach trawiennych, ale także w krzepnięciu krwi, zapaleniu i szeroko pojętej odpowiedzi immunologicznej
•
Proteaza musi rozpoznać i związać region łańcucha polipeptydowego, w którym znajduje się wiązanie do przecięcia
•
Trzy klasy proteaz serynowych:
•
Chymotrypsyn, subtylizyn i karboksypeptydaz II
•
Triada Ser, His, Asp jest konserwatywna
•
Mechanizm katalizy wspólny
Wahadło protonowe:
•
Ułatwia szybką regenerację aktywnej formy enzymu
•
Podstawowym składnikiem tego wahadła jest His 64
Kataliza nukleofilowa:
•
Tworzy się wiązanie kowalencyjne między nukleofilem enzymu i grupą na cząsteczce substratu w stanie przejściowym reakcji
•
Jest czynnikiem, który najbardziej zwiększa reaktywność stanu przejściowego substratu w stosunku do stanu podstawowego
•
Nukleofilowy atak reszty Ser na karbonyl substratu proteazy serynowej z utworzeniem pośrednika enzym- acyl jest przykładem katalizy tego typu
Kataliza elektrofilowa:
•
Tworzą się pośredniki między kationowym elektrofilem enzymu i bogatą w elektrony częścią cząsteczki substratu
•
Grupy elektrofilowe pochodzą od kofaktorów organicznych
Kinazy monofosforanów nukleozydów:
•
Enzymy te katalizują przeniesienie końcowej grupy fosforanowej z trójfosforanu nukleozydu ATP na grupę fosforanową monofosforanu nukleozydu
•
Proces musi tak przebiegać żeby fosforan nie został przeniesiony na cząsteczkę wody; ATP zostałby wtedy zhydrolizowany
•
Enzymy te są nie aktywne, gdy brak Mg2+ Mn2+
Rzędowość reakcji:
Mówi nam o tym jak na szybkość reakcji wpływają stężenia substratów w danych warunkach
•
Reakcje pierwszego rzędu to reakcje, których szybkość jest proporcjonalna do stężenia jednego substratu
•
Reakcje drugiego rzędu to takie, których szybkość jest proporcjonalna do stężenia produktu utworzonego przez dwa substraty lub kwadratu stężenia jednego substratu
•
Reakcje pseudo pierwszego rzędu - jeśli stężenie B jest bardzo wysokie , a stężenie A bardzo niskie to taka reakcja wydaje się, że jest I-rzędu , ponieważ jej szybkość będzie prawie proporcjonalna do stężenia A
•
Reakcje trzeciego rzędu są stosunkowo rzadkie, ich szybkość jest proporcjonalna do ilości produktu powstałego z trzech stężeń substratów
•
Reakcje zerowego rzędu - niezależne od stężenia jakichkolwiek substratów
Czas połówkowy:
•
Mówi nam o tym w jakim czasie połowa substratu została przekształcona w produkt
•
W reakcjach I-rzędu czas połówkowy nie zależy od początkowego stężenie substratu
Kinetyka stanu stacjonarnego:
•
Przy niskim stężeniu substratu początkowa szybkość reakcji jest prawie proporcjonalna do stężenia substratu
•
W miarę jak rośnie stężenia substratu, szybkość początkowa rośnie wolniej, co znaczy, że nie jest już proporcjonalna do stężenia substratu, a jej rzędowość mieszana
•
Z dalszym wzrostem stężenia substratu reakcja staje się niezależna od jego stężenia i asymptotycznie osiąga stała szybkość
•
Gdy stężenie substratu jest tak wysokie, że cały enzym jest związany w kompleksie z substratem (nasycenie), wtedy szybkość początkowa staje się szybkością maksymalną
Równanie Michaelisa-Menten:
•
Wyraża matematyczną zależność między szybkością początkową reakcji enzymatycznej , stężenie substratu i niektórymi cechami enzym
•
Vo=Vmax [S] /(Km +[S])
Stała Michaelisa-Menten:
•
Nie jest stałą wartością, zależy od rodzaju substratu, zmienia się wraz z pH i temperaturą
•
Jest ważna nie tylko dlatego, że opisuje matematycznie kinetykę enzymu, ale także dla ilościowego pomiaru aktywności enzymów w tkankach i w trakcie oczyszczania białka
•
Jest też wskaźnikiem istnienia mechanizmów regulujących
•
Wskazuje na panujące w komórce stężenie substratu
•
Można porównywać enzymy z różnych organizmów albo z różnych tkanek tego samego organizmu
•
Można wskazać fizjologiczne inhibitory enzymu
•
Wskazuje na dopasowanie alternatywnego substratu do enzymu
•
Jest wielkością wyznaczoną eksperymentalnie, zdefiniowaną ilościowo jako stężenie substratu przy, którym szybkość reakcji stanowi połowę szybkości maksymalnej
Stała substratowa:
•
Stała dysocjacji kompleksu ES
Wykres Eadie-Hofstee:
•
Wykres nie tylko, że dostarcza Vmax i Km ale ułatwia dostrzeżenie odchyleń od liniowości, czego można nie zobaczyć na wykresie podwójnie odwrotnościowym Lineweavera-Burka
•
Pomnożenie obu stron równanie Lineweavera-Burka przez Vmax
Wpływ pH na aktywność enzymów:
•
III rzędowa struktura białka jest wrażliwa na pH, przy skrajnych pH następuje denaturacja enzymu
•
większość enzymów stabilna w pH około 7,4
•
Wpływ pH na szybkość katalizy, szybkość tworzenia produktu wskazuje na zaangażowanie grup kwasowo-zasadowych w etap katalityczny substrat – produkt
Wpływ temperatury na aktywność enzymów:
•
Reakcje enzymatyczne tak jak reakcje chemiczne zwiększają swoja szybkość pod wpływem temperatur
•
Enzymy są białkami i ulegają denaturyzacji pod wpływem wysokiej temperatury
Czynniki wpływające na szybkość reakcji:
•
temperatura
•
siła jonowa
•
stężenie anionów i kationów
•
pH
Wyrażanie aktywności enzymów:
•
V0 i Vmax wyrażamy w molach/jednostkę czasu
•
Km w molach/litr czyli w M
•
kcat 1/min, min-1s-1
•
Jedna jednostka międzynarodowa (1U) to taka ilość enzymu, która katalizuje utworzenie 1 mola produktu na minutę w określonych warunkach
•
Liczba obrotów (aktywność cząsteczkowa) to liczba moli substratu przemienionego w ciągu min przez mol enzymu (jednostki/ m
ol enzymu) w warunkach optymalnych
Aktywność specyficzna enzymów:
•
Stężenie enzymu w nieoczyszczonym preparacie podaje się jako specyficzną aktywność (jed/mg białka)
•
Aktywność specyficzna białka enzymatycznego rośnie w miarę tego jak coraz większą masę białka enzymatyczngo stanowi nasz enzym, czyli w miarę jak postępuje oczyszczanie
Sposoby pomiaru aktywności enzymów:
•
Spektroskopia
•
Polarografia
•
Rozpad radioaktywny
•
Rozdział elektroforetyczny
•
Rozdział chromatograficzny
•
Immunoreaktywność
•
Można także mierzyć interesujący nas produkt przy pomocy reakcji sprzężonych, z których ta druga jest łatwa do mierzenia
P
rzesunięcie Stokesa :
•
Jest to przesunięcie maksimum pasma absorpcji względem pasma emisji dla tego samego stanu wzbudzonego
•
Przesuniecie to może być wyrażone w długościach fali, nm, liczbach falowych lub hercach Zastosowanie izotopów radioaktywnych:
•
Podstawowa strategia wykorzystania izotopów do pomiarów szybkości reakcji to inkorporacja w strukturę substratu składnika radioaktywnego, który po katalizie można odzyskać w produkcie
•
Dzięki temu można mierzyć ilość radioaktywności we frakcjach substratu i produktu wnioskując z tego o ubytku substratu i przyroście produktu.
I nne metody detekcj i :
•
Metody immunologiczne: śledzenie proteolizy białek przy pomocy przeciwciał przeciw substratowi białkowemu
•
Metody polarograficzne: wiele oksydaz wykorzystuje tlen cząsteczkowy do katalizy, mierzy się ubytek O2 z roztworu, w którym zachodzi kataliza przy pomocy elektrody tlenowej
O
czyszczanie białe k
:
•
Do separacji cząsteczek wykorzystuje się różnice w ich wielkości, masie, ładunku elektrycznym lub powinowactwie do innych cząsteczek
Pierwszy krok do izolacji białek, wiec enzymów, polega na skutecznym uszkodzeniu komórek i tkanek i oddzieleniu białek rozpuszczalnych od jąder, fragmentów ścian komórkowych i innych struktur
•
Sedymentacja przy użyciu rotora o określonym kącie położenia probówek
•
Dializa:
•
Pozbawia białka substancji niskocząsteczkowych stosowanych na różnych etapach oczyszczania
•
Stosowane są tu półprzepuszczalne pory maja pory wystarczająco duże, żeby mogły przez nie przechodzić małe cząsteczki.
•
Białka i inne duże cząsteczki pozostają w worku dializacyjnym
Metody chromatograficzne:
•
Chromatografia jonowymienna:
•
Polega na wymianie zdolnych do wymiany jonów (+ lub -) jonitu na inne jony o tym samym ładunku zawarte w roztworze
•
Jonity to substancje wielkocząsteczkowe, w których wyodrębnia się matryce w postaci gąbczastej sieci przestrzennej oraz grupy chemicznie czynne, g. funkcyjne, kwasowe lub zasadowe, połączone z jonami o znaku przeciwnym
•
Kationy wymieniają kationy, które oddysocjowują od anionów.
•
Aniony wymieniają aniony, które oddysocjowują od kationów.
•
Filtracja żelowa:
•
Do rozdzielenia składników mieszaniny o różnych cząsteczek można stosować struktury porowate (żele), pełniące w procesie rozdziału rolę sita
•
Jony oraz substancje drobnocząsteczkowe dyfundują łatwo wgłąb ziaren żelu
•
Sefadeks jest odpowiednio chemicznie zmienionym dekstranem
•
Chromatografia powinowactwa:
•
Wykorzystuje powinowactwo białek do specyficznych grup chemicznych
•
Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa HPLC:
•
Nośniki muszą być odporne na ściskanie
•
W wysokim ciśnieniu do 5000 psi można zastosować szybki przepływ
•
Chromatografia oddziaływań hydrofobowych HIC:
•
Jest wykorzystywana do separacji i oczyszczania makrocząsteczek białkowych
•
Białka adsorbują się na złożu dzięki występowaniu oddziaływań hydrofobowych fragmentów białka z silnie hydrofobowymi grupami ligandów trwale umocowanych na powierzchni
nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego
Elektroforeza:
•
SDS-PAGE do rozdziału peptydów i białek na podstawie ich mas cząsteczkowych
•
SDS (detergent anionowy) nadaje im podobną gęstość ładunku (-)
•
Nałożona na żel mieszanina białek i peptydów migruje do anody w polu elektrycznym podłączonym do żelu Migrację cząsteczek opóźnia spolimeryzowany żel
•
Stopień opóźnienia zależy od masy cząsteczkowej białek
Inhibitory:
•
Są narzędziem do badania mechanizmów reakcji enzymatycznych
•
Stanowią mechanizmy kontrolne w biologi
Inhibicja nieodwracalna:
•
Tworzenie kowalencyjnych wiązań między określonymi grupami enzymu i inhibitora
•
Inhibitory ciasno wiązane
•
Współzawodnicza i niewspółzawodnicza
•
Inhibitory odwracalne wiążą się z enzymami szybko i szybko dysocjują
Stała inhibicji:
•
Mierząc obniżanie się szybkości początkowej reakcji wraz ze wzrostem stężenia inhibitora można wyznaczyć Ki
•
Czynnik alfa odzwierciedla wpływ inhibitora na powinowactwo enzymu do substratu i wpływ substratu na powinowactwo enzymu do inhibitora
•
Czynnik beta odzwierciedla zmianę szybkości tworzenia produktu jaką powoduje inhibitor Inhibicja kompetycyjna:
•
Inhibitor wiąże się bezpośrednio do miejsca wiązania substratu lub na tyle blisko żeby zablokować to miejsce
•
Inhibitor kompetycyjny musi mieć strukturalne podobieństwo do substratu
•
Zwiększenie stężenia substratu powoduje zmniejszenie inhibicji na skutek współzawodnictwa inhibitora i substratu o miejsce wiązania
Inhibicja niekompetycyjna:
•
Inhibitor tego typu wiąże się z enzymem w miejscu innym niż to wiążące substrat i hamuje reakcję przez jeden z wielu różnych mechanizmów
•
Zwiększenie stężenia substratu nie zmniejsza stopnia inhibicji, bo ligandy nie współzawodniczą o to samo miejsce wiązania
Inhibicja akompetycyjna:
•
Inhibitor akompetycyjny wiąże się w miejscu innym niż miejsce wiążące substrat, ale raczej do kompleksu enzym-substrat niż do wolnego enzymu
I nhibitory o
parte na mechanizmie reakcji:
•
Inhibitory wywołujące samobójstwo enzymu
•
Inhibitor wiąże się do enzymu jak substrat, co początkowo prowadzi do normalnego mechanizmu katalitycznego
•
Tworzy się aktywny intermedia, który hamuje enzym przez modyfikację kowalencyjną
•
Kowalencyjnie zmodyfikowana grupa enzymu jest aktywna katalitycznie, na co wskazuje fakt, że enzym uczestniczy we własnej nieodwracalnej inhibicji.
Penicylina:
•
Jest pierwszym odkrytym antybiotykiem
•
Penicylina blokuje ostatni etap biosyntezy ścian bakteryjnych, reakcję tworzenia wiązań poprzecznych między różnymi łańcuchami peptydoglikanu
I nhi
bicj a
c
iasno związan a
:
•
Wiążą się z enzymem z tak wysokim powinowactwem, że wiązanie inhibitora przez enzym w istotny sposób zmienia stężenie wolnego inhibitora
•
W bardzo wysokim stężeniu substratu wykres obniża się, a krzywe w różnych stężeniach inhibitora zbiegają się na osi y
Inhibitor powoli wiązany:
•
Powstawanie produktu w reakcji hamowanej inhibitorem powoli wiązanym nie przebiega liniowo
•
W czasie preinkubacji enzymu z inhibitorem ustala się między nimi równowaga i dodanie substratu ją zaburza Aktywność enzymów regulują:
•
Inhibitory i aktywatory
•
Oddziaływania al osteryczne - kontrola aktywności enzymu za pomocą substratu
•
Wiązanie białek stymulujących i hamujących
•
Odwracalne modyfikacje kowalencyjne – np. fosforylację
Aktywacja proteolityczna (proenzym)
•
Regulacja syntezy i rozkładu enzymu
Hemoglobina i mioglobina:
•
Hemoglobina wykorzystuje 90% swych możliwości przenoszenia tlenu, a mioglobina w podobnych warunkach tylko 7% potencjału
•
Cząsteczka hemoglobiny jest zbudowana z czterech łańcuchów polipeptydowych, a mioglobiny z jednego
•
Hemoglobina swoją efektywność zawdzięcza oddziaływaniom między łańcuchami, które powodują, że związanie tlenu w swoistym miejscu jednego łańcucha zwiększa prawdopodobieństwo, że pozostałe łańcuchy zwiążą tlen również (kooperatywne wiązanie ligandów)
•
Hemoglobina składa się z dwóch łańcuchów α i dwóch łańcuchów β. Białko funkcjonuje jako para dimerów αβ.
•
Cząsteczki w stanie R (relaxed) mają większe powinowactwo do tlenu niż w stanie T (tense) - cząsteczki przechodzą ze stanu T do R w miarę wiązania cząstek tlenu
•
W modelu sekwencyjnym związanie ligandu do jednego miejsca w układzie zwiększa możliwość związania w miejscach sąsiednich bez uruchamiania pełnego przekształcania stanu T do stanu R - związanie ligandu zmienia konformację podjednostki, do której się związał
•
Zerwanie wiązań między Hb i 2,3 BPG powoduje przejście stanu T w stan R
•
Obecność CO2 zmniejsza powinowactwo Hb do tlenu w stopniu wykraczającym poza wpływ pH
Hem – grupa prostetyczna hemoglobiny:
•
Zdolność hemoglobiny i mioglobiny do wiązania tlenu zależy od hemu, grupy prostetycznej, zawierającej atom żelaza
•
Związaniu tlenu z żelazem w hemie towarzyszy częściowe przeniesienie elektronów na tlen W
pł
yw p H
na powinowactwo H
b
do tlenu:
•
Powinowactwo Hb do tlenu zmniejsza się wraz z obniżaniem pH z 7,4 do 7,2
Wykres Hilla:
•
Współczynnik Hil a jest miarą kooperatywności wiązania tlenu
Efekt Bohra:
•
Zjawisko występujące w fizjologi , polegające na zmniejszaniu powinowactwa hemoglobiny do tlenu w warunkach obniżonego pH
•
Powoduje to, że tlen jest łatwiej oddawany przez hemoglobinę (dysocjacja) tlenu