15.04.2005 - Ćwiczenia 8

TEMAT: APOPTOZA

Apoptoza - programowana śmierć komórki, przebiega zarówno w procesach fizjologicznych jak i patologicznych, jest wynikiem ekspresji określonych genów i zachodzi w wyniku określonych zmian biochemicznych. Odgrywa zasadniczą rolę w homeostazie organizmu zarówno w trakcie procesów rozwojowych jak i w rozwoju postembrionalnym. Komórki ogona kijanki, przewody Mullera u samców, mezenchyma między palcami kręgowców - giną w wyniku apoptozy. Apoptoza dotyczy także złuszczania się nabłonków (np. macicy), inwolucji narządów, oraz wielu chorób tj. AD, usuwane są także zbędne i szkodliwe komórki.

Nekroza - śmierć komórki pod wpływem czynników uszkadzających

NEKROZA

• Niespecyficzna degradacja DNA

• Wzrost objętości i pęcznienie komórki

• Uszkodzenie organelli komórkowych

• Obrzęk mitochondriów

• Przenikanie składników organelli do cytoplazmy

• Uszkodzenie chromatyny

• Liza komórki i jej organelli

• Destrukcja organelli komórkowych i chromatyny

• Fagocytoza przez kmórki układu immunologicznego z wywołaniem stanu zapalnego

• Niezależna od ATP

APOPTOZA

• Precyzyjna i charakterystyczna degradacja DNA

• Zmniejszenie objętości komórki

• Nieuszkodzone organella komórkowe zachowują integralność

• Grube ziarna chromatyny powstałe pod wpływem endonukleaz gromadzą się na obwodzie jądra komórkowego

• Fragmentacja chromatyny

• Rozpad komórki

• Tworzenie się i uwalnianie ciałek apoptotycznych

• Nienaruszona struktura organelli

• Fagocytoza przez sąsiadujące komórki towarzyszące bez stanu zapalnego

• Wymaga dopływu energii

Czynniki indukujące i hamujące apoptozę:

Biologiczne:

Hamujące

• Czynniki wzrostu

• Estrogeny, androgeny

• Ligand CD-40

• Białko BCL-2

• Białka wirusowe

Chemiczne:

• Inhibitory proteaz cysteinowych

• Fenobarbital

Fizyczne:

Indukujące

• Brak czynników wzrostu

• Rodzina białek TNF

• Neurotransmitery

• Glukokortykoidy

• Infekcje wirusowe

• Onkogeny

• Geny supresorowe nowotworów

• Wolne rodniki

• Cytotoksyczne limfocyty T

• Etanol, aldehyd mrówkowy

• Leki cytostatyczne

• Wolne rodniki

• Promieniowanie gamma, UV

• Wysoka temperatura

Przebieg apoptozy:

1. Faza indukcji

1. Zadziałanie czynników spustowych - czynniki wzbudzające apoptozę

2. Przekazanie sygnału z układu receptorowego - następuje przez szereg cząsteczek pośredniczących tj. FADD, TRADD

3. Modulowanie sygnału - regulowany przez cząsteczki rodziny białek bcl-2

2. Faza wykonawcza - pobudzenie grupy kaspaz prowadzi do reakcji lawinowej i w rezultacie do cięcia innych substratów, jej wynikiem jest wejście w fazę zniszczenia

3. Faza zniszczenia - kończy się fagocytozą, przed nią komórka traci asymetrię części lipidowej błony komórkowej

Szlaki indukcyjne apoptozy:

1. Zewnętrzny (szlak błonowy) - zależny od układu receptor-ligand CD95/CD95L. Receptor CD95 jest zawieszony w błonie komórkowej i po związaniu się z ligandem CD95 następuje jego trimeryzacja. Po cytozolowej stronie receptor ten zawiera sekwencję DD (Death Domain) dzięki której dołącza się cząsteczka FADD ,bo zawiera także domenę DD na jednym z końców. Na drugim końcu FADD zawiera domenę DED (Death Efector Domain) która aktywuję kaspazę 8 i przez to wywołuje reakcję lawinową kaspaz

2. wewnętrzny (szlak mitochondrialny) - mitochondria posiadają cytochrom c. Na skutek jego uwalniania zachodzącego przy udziale białek BAX,BAD, BAK oraz białek z rodziny bcl-2 - są to wszystko białka kanałowe dla cytochromu c - tworzy on kompleks z białkiem APAF-1,DATP i prokaspazą 9 zwany apoptosomem. Apoptosom aktywuje łańcuchową reakcję kaspaz

3. pseudoreceptorowy

Białka trawione przez kaspazy:

• białko PARP - bierze udział w rozpoznawaniu uszkodzeń DNA

• białko ICAD - proteolina tego białka uruchamia CAD, które tnie DNA

• białko Rb - reguluje przejście cyklu komórkowego

• białko mdm2 - wiąże się z p53 i reguluje jego stabilność

• aktyna

• laminina

• topoizomeraza I i II

• acinus - odpowiedzialne za kondensację chromatyny jądrowej

Rodzaje kaspaz:

• są to białka fazy wykonawczej apoptozy

• enzymy działające na zasadzie proteazy cysteinowej

• znane jest 14 kaspaz, są produkowane w postaci nieaktywnej jako prokaspazy

• kaspazy wykonawcze : 3,6,7

• kaspazy inicjujące: 8,9,10

• kaspaza 3 - składa się z heterodimeru 17kD i 12kD

Nowotwór - nieprawidłowa tkanka, która rozrasta się nadmiernie i niezależnie od mechanizmów kontroli. Rozrost ten spowodowany jest nadmierną i niepohamowaną proliferacją komórek, która następuje nawet po wyeliminowaniu czynnika który ją wywołał - nieczuła na apoptozę.

Nowotwory mogą być: łagodne (nie dają przerzutów i nawrotów), złośliwe (dają przerzuty i nawroty, np. rak - tkanka nabłonkowa i mięsak - tkanka nienabłonkowa), miejscowo złośliwe (dają tylko nawroty a nie dają przerzutów np. rak podstawno-komórkowy)

Elementy obrony nowotworów przed apoptozą:

1. zwiększony poziom białek antyapoptotycznych bcl-2, bcl-x

2. inaktywacja białek proapoptotycznych BAX, BAK

3. wzrost inhibitorów apoptozy IAP(surwiwina), FLIP

• białaczki, chłoniaki, glejaki - nadekspresja bcl-2

• czerniaki - nadekspresja FLIP

• nowotwory przewodu pokarmowego - nadekspresja surwiwiny

Wykrywanie apoptozy:

1. hemotoksylina Meyera

1. wybarwienie skondensowanej chromatyny

2. tworzenie się ciałek apoptotycznych

3. trawienie

2. użycie aneksyny U-Cy3 - transport fosfatydyloseryny z błony wewnętrznej na zewnętrzną, dołącza się tam aneksyna U i wykrywa się apoptozę bo z aneksyną idzie jodek propidyny

3. wykrywanie pociętego DNA - tzn drabinka DNA

4. metoda TUNEL - wykrywanie fragmentów 3'OH - tam dołączają się znakowane nukleotydy a następnie znakowane przeciwciała

5. metoda kometkowa - stosowana dla komórek z hodowli, na szkiełko dajemy agarozę, odwirowywujemy komórki i następuje ich liza, wykrywa się dwuniciowe pęknięcia DNA, które wędrują do bieguna +

1

---