Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka

Przedmiot: Enzymologia

Temat ćwiczenia:

HYDROLIZA SACHAROZY - WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA DLA INWERTAZY DROŻDŻOWEJ

Wprowadzenie:

Inwertaza (E.C. 3.2.1.26) jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy. Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć sacharozę do łatwo przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza. U ludzi inwertaza, podobnie jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito cienkie. Inwertaza występuje też w ślinie pszczół i bierze udział w przetwarzaniu cukru z nektaru kwiatowego do cukrów prostych.

W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji czekoladek nadziewanych półpłynnym nadzieniem. Podczas produkcji nadzienie w postaci stałej (głównym składnikiem jest sacharoza) pokrywane jest czekoladą, a następnie w ciągu kilkutygodniowego „dojrzewania“ czekoladek w wyniku działania inwertazy dodanej w procesie produkcji, sacharoza rozkładana jest do fruktozy i glukozy, które chłonąc wilgoć ze środowiska powodują w efekcie upłynnienie nadzienia.

Celem ćwiczenia jest poznanie właściwości hydrolitycznych inwertazy z drożdży.

Wykonanie ćwiczenia:

Zadanie 1. Otrzymywanie preparatu inwertazy z drożdży

2 g drożdży rozetrzeć w moździerzu z piaskiem, dodać ok. 10 cm³ wody i ponownie dokładnie rozetrzeć i odwirować. Supernatant wlać do 5-krotnej objętości acetonu. Wytrącony osad rozpuścić w 10 cm³ wody i przesączyć. Przesącz zawierający enzym można przechowywać w lodówce kilka tygodni.

Zadanie 2. Oznaczanie aktywności inwertazy

1 g drożdży rozprowadzić w 6 ml ciepłej wody (do 40^oC). Przygotować 2% roztwór sacharozy (stężenie substratu ustalić z prowadzącym). Do probówki wprowadzić 20 ml roztworu substratu, a następnie dodać 5 ml roztworu enzymu. Pobierać próbkę co 1 - 5 min (w zależności od otrzymywanych wyników - czas ustalać z prowadzącym) i sprawdzać stężenie glukozy metodą Luffa-Schoorla, wg dołączonej metodyki. Reakcję prowadzić, w zależności od wyników, przez 5 - 25 min.

Badanie powtórzyć dla innego stężenia substratu.

Narysować wykres oraz wyznaczyć rząd reakcji, stałą szybkości reakcji k i szybkość początkową dla każdego stężenia substratu. W przypadku oznaczeń dla kilku stężeń substratu wyznaczyć K_M oraz V_max.

Zadanie 3. Do probówki wprowadzić inny substrat (np. rozcieńczone mleko) oraz enzym w ilościach j.w. i zbadać stężenie glukozy po czasie odpowiadającym maksymalnemu stężeniu glukozy w poprzedniej części ćwiczenia.

Zadanie 4. Powtórzyć doświadczenie 2, dodając do enzymu NaCl w takiej ilości, by otrzymać ostateczne stężenie w próbie 5%.

Zadanie 5. Wyniki zestawić w tabeli/tabelach oraz przedstawić na wykresie/wykresach (zależność stężenia produktu od czasu, stężenia substratu od czasu, wykres Michaelisa-Menten i Lineweavera-Burka). Określić działanie NaCl na przebieg reakcji enzymatycznej.

Zadanie 6. Oznaczyć stężenie enzymu w roztworze metodą biuretową.

Oznaczanie stężenia białka metodą biuretową: Do kolbek odmierzyć po 1 cm³ kolejnych prób (do próby ślepej użyć wody destylowanej), dodać po 4 cm³ odczynnika miedziowego, do drugiego zestawu dodać po 4 cm³ odczynnika zmętnieniowego. Wszystkie próby wykonywać w 3 powtórzeniach. Po 30 min odczytać absorbancję przy długości fali 540 nm. Zawartość białka odczytać z krzywej wzorcowej (po uwzględnieniu zmętnienia), zestawić wyniki, biorąc pod uwagę rozcieńczenie.

Zagadnienia do przygotowania:

1. Wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznych.

2. Inwertaza i oksydaza glukozowa.

3. Izolacja i oczyszczanie enzymów.

Literatura:

1. Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): „Ćwiczenia z biochemii”, PWN Warszawa - Poznań 1982.

2. Stryer L.: „Biochemia”, PWN Warszawa 1986.

3. Dziuba J., Kostyra H.: „Biochemia żywności (metody, zadania i testy)”, Wydawnictwo UW-M w Olsztynie, Olsztyn 2000.

4. Kołakowski E., Bednarski W., Bielecki S. „Enzymatyczna modyfikacja składników żywności”, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Szczecin 2005.

---