Sprawozdanie

Inżynieria bioreaktorów – laboratorium

„Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji hydrolizy sacharozy”

Wstęp teoretyczny

Inwertaza jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy lub pochodnych glikozydów [1]. Uczestniczy ona w przeniesieniu reszt fruktozowych na akceptory inne niż woda [1]. Inwertaza należy więc do grupy hydrolaz i transferaz.

Aktywność hydrolityczna inwertazy jest hamowana przez wolne heksozy oraz alkohole, ponieważ są one akceptorami reszt fruktozowych w reakcjach transferazowych [1]. Działanie inwertazy może być hamowane dwiema innymi drogami: inhibicją kompetycyjną lub inhibicją niekompetycyjną [2].

Inhibicja kompetycyjna, zwana również konkurencyjną zachodzi wtedy, gdy inhibitor współzawodniczy z substratem o miejsce aktywne w enzymie. Zazwyczaj jest to spowodowane dużym podobieństwem strukturalnym substratu i inhibitora [3,4]. Gdy w środowisku reakcji jest nieskończenie duże stężenie substratu, może on wyprzeć inhibitor z enzymu [4]. W tej inhibicji parametr kinetyczny V_max (szybkość maksymalna) nie zmienia się w przeciwieństwie do stałej Michaelisa K_M, której wartość rośnie [4].

Drugi typ hamowania enzymu to inhibicja niekompetycyjna zwana również niekonkurencyjną, polega na wiązaniu się inhibitora i substratu do różnych miejsc w enzymie i zmianie strukturalnej białka [3,4].

W przypadku tej inhibicji zmienia się szybkość maksymalna V_max, a stała Michaelisa K_M pozostaje niezmieniona [4].

Szczególnym przypadkiem inhibicji jest inhibicja substratem lub produktem [2]. W hamowaniu substratem przy miejscu aktywnym enzymu gromadzi się wiele cząsteczek substratu. To nagromadzenie substratu uniemożliwia powstałemu produktowi opuszczenie miejsca aktywnego enzymu, przez co zablokowana jest dalsza kataliza reakcji [5]. Co więcej, substrat aby móc uczestniczyć w reakcji potrzebuje się uwodnić. Z tego powodu jego akumulacja przy enzymie powoduje, że struktura białka usztywnia się i nie może katalizować kolejnych reakcji. Inhibicja substratem zmniejsza się wraz z upływem czasu, gdy część substratu zostaje przekształcone przez enzym w produkt – następuje zmniejszenie stężenia substratu w środowisku reakcji. W tym momencie może wystąpić inhibicja produktem, którego nagromadzenie może uniemożliwić dalsze katalizowanie reakcji przez enzym [2].

Zdolność inwertazy do hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy czyli tzw. cukru inwertowanego jest wykorzystywana w przemyśle do produkcji syropu cukrowego inwertowanego [2].

Reaktor okresowy mieszalnikowy jest często wykorzystywany do badania kinetyki reakcji. Charakteryzuje się dużą szybkością reakcji oraz nieustalonym stanem pracy. Stan nieustalony informuje, że w reaktorze parametry zmieniają się w czasie np. stężenie, stopień przereagowania. Jest to spowodowane tym, że do reaktora okresowego wprowadza się jednorazowo mieszaninę reakcyjną, a po wyczerpaniu substratów reaktor opróżnia się. Między kolejnymi opróżnieniami i napełnieniami reaktora występuje czas jałowy. Jest to czas bezproduktywny między procesami reakcyjnymi, zazwyczaj przeznaczony jest na przygotowanie reaktora przed procesem. Przy założeniu, że w reaktorze okresowym nie ma przepływu strumienia (nie ma wymiany masy z otoczeniem) można wyprowadzić równanie bilansu materiałowego w postaci [6]:

$- r_{s} \bullet V_{R} = V_{R} \bullet \frac{\text{dC}_{s}}{\text{dt}}$ (1)

r_s – szybkość reakcji

V_R – objętość reaktora

C_s – stężenie substratu w czasie

t – czas

W wyniku uproszczenia wzoru (1) otrzymujemy wzór na szybkość reakcji, która zależy od szybkości akumulacji [6]:

$r_{s} = - \frac{\text{dC}_{s}}{\text{dt}}$ (2)

Na podstawie przedstawionego wzoru można stwierdzić, że wraz ze spadkiem stężenia substratu maleje szybkość reakcji.

Ze wzoru (2) wyznaczamy czas reakcji:

$$t_{r} = - \int_{C_{s,o}}^{C_{s}}\frac{\text{dC}_{s}}{r_{s}} = \int_{C_{s}}^{C_{s,o}}\frac{\text{dC}_{s}}{r_{s}}\ $$

C_s – stężenie substratu w czasie

C_s,o – stężenie początkowe substratu

Mimo wielu korzyści płynących z użytkowania reaktora, jego zastosowanie ma wiele wad m.in. mała wielkość produkcji, czas jałowy oraz utrudniona kontrola i regulacja procesu wynikająca ze stanu nieustalonego.

W przeprowadzonym doświadczeniu reaktor okresowy mieszalnikowy jest używany, aby zweryfikować wyniki uzyskane w reaktorach mieszalnikowych.

W doświadczeniu wykorzystano metodę początkowych warunków reakcji do wyznaczenia parametrów równania kinetycznego. W metodzie tej przeprowadza się doświadczenie, które spełnia założenia kinetyki Michaelisa-Menten:

• Założenie prędkości początkowej – ignoruje się reakcje, w których enzym i produkt mogłyby odtworzyć kompleks enzym – substrat [ES] i ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat. Założenie to jest spełnione w początkowym etapie reakcji przy początkowej szybkości, zanim stężenie produktu stanie się znaczące [3,4].

• Założenie stanu stacjonarnego – stężenie kompleksu enzym substrat szybko osiąga stałą wartość poprzez to, że kompleks [ES] jest tworzony z taką szybkości z jaką ulega on rozpadowi do enzymu i produktu lub dysocjacji do enzymu i substratu w reakcji odwrotnej [3,4]

• W reakcji uczestniczy tylko jeden substrat lub jeśli reakcja jest wielosubstratowa, stężenie tylko jednego substratu zmienia się, a wszystkich innych zachowuje stałą wartość [4].

• Stężenie substratu jest większe niż stężenie enzymu, a stężenie enzymu pozostaje stałe w czasie prowadzenia doświadczenia [3].

C_s,max ∼ 20 * K_M ∼ 95% V_max

C_{s, min} ≥ 0,5 * K_M,

Gdzie K_M – stała Michaelisa, V_max – szybkość maksymalna

• Temperatura, pH, siła jonowa są stałe [4].

Temperatura powinna być o 5 – 10 °C niższa niż temperatura optymalna, aby nie spowodować denaturacji części enzymu.

pH natomiast powinno być utrzymywane na poziomie optymalnym dla danego enzymu. Wtedy enzym jest najbardziej stabilny.

Przygotowując się do przeprowadzenia doświadczenia metodą początkowych warunków reakcji należy dobrać odpowiedni czas reakcji. Reakcje najlepiej przerwać, gdy stopień przereagowania substratu nie będzie większy niż 5%. Następnie z otrzymanych wyników sporządza się wykres zależności r = f(C_s). Jeżeli wykres jest zgodny z oczekiwaniami, oznacza to, że reakcja przebiegała zgodnie z kinetyką Michaelisa – Menten (MM). Z linearyzacji tego wykresu sporządza się wykres Lineweavera – Burka (LB), powstaje zależność 1/r = f(1/C_s). Kolejno wyznacza się z równania prostej parametry K_M (stała Michaelisa) oraz V_max (szybkość maksymalna reakcji).

W przypadku, gdy kształt wykresu MM i LB odbiega od standardowego, mamy reakcję o  niestandardowej kinetyce, co więcej enzym jest hamowany przez inhibitor. Wiadomo, że w reakcji brał udział tylko substrat i enzym, więc inhibitorem może być produkt lub substrat reakcji. Z tych danych wyklucza się inhibicję produktem, gdyż doświadczenie rozpatrywane jest przy stężeniu początkowym, gdy nie powstał jeszcze produkt i w takim przypadku wykres MM ma taką samą postać, jak dla reakcji bez inhibitora.

W celu zweryfikowania podejrzenia o inhibicję sporządza się wykres zależności czasu rzeczywistego reakcji od stężenia substratu i porównuje z wykresem zależności czasu modelowego od stężenia substratu. Czas modelowy dla danej reakcji wylicza się z postaci całkowej równania Michaelisa – Menten:

$$t = \frac{1}{V_{\max}} \bullet \left( K_{m} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} \right)$$

gdzie:

t – czas

C_0,s – stężenie początkowe substratu

C_s – stężenie substratu po czasie t

V_max – szybkość maksymalna reakcji

K_M – stała Michaelisa

Jeżeli oba wykresy się pokrywają, to w reakcji nie bierze udział inhibitor. Natomiast jeżeli się nie pokrywają, to reakcja jest hamowana. Można w ten sposób potwierdzić inhibicję substratem i wykryć inhibicję produktem. W takim przypadku wyznaczamy czasy modelowe dla inhibicji substratem lub inhibicji produktem:

• Dla inhibicji substratem $t = \frac{1}{V_{\max}} \bullet \left( K_{m} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} + \left( \frac{1}{2 \bullet K_{\text{is}}} \bullet \left( C_{0,s}^{2} - C_{s}^{2} \right) \right) \right)$

• Dla inhibicji produktem $t = \frac{1}{V_{\max}} \bullet \left( K_{m} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} + \left( \left( 1 - \frac{\text{Km}}{\text{Ki}} \right) \bullet \left( C_{0,s} - C_{s} \right) \right) \right)$

Następnie rysujemy funkcje t_rzeczywisty=f(C_s) oraz t_modelowy=f(C_s). Jeżeli narysowane funkcje dla czasu rzeczywistego i czasu modelowego dla inhibicji pokrywają się mamy do czynienia z inhibicją enzymu substratem lub produktem.

Parametry kinetyczne reakcji można wyznaczyć regresją nieliniową, korzystając z programu Origin Pro 8.0.

W programie tworzy się wykres MM, wprowadza szacunkowe wartości K_M i V_max oraz równanie krzywej: $V = \frac{V_{\max} \bullet C_{s}}{K_{M} + C_{s}}$ . Program z regresji nieliniowej wyznacza dokładne parametry wraz z błędem analitycznym.

W taki sam sposób można rozpatrzyć reakcję z inhibitorem, którym jest substrat. Wprowadza się szacunkowe wartości K_M, V_max oraz K_is (parametr charakterystyczny dla inhibicji substratowej, nie jest się go w stanie wyznaczyć z regresji liniowej, dlatego przyjmuje się, że musi być większy od K_M). Równanie krzywej ma postać : $V = \frac{V_{\max} \bullet C_{s}}{K_{M} + C_{s} + \frac{C_{s}^{2}}{K_{\text{is}}}}$, a z regresji nieliniowej otrzymuje się dokładne wartości parametrów kinetycznych.

Cel ćwiczenia

Zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych równania kinetycznego.

Odczynniki

• inwertaza otrzymana nieodpłatnie z firmy Novozyme;

• roztwór sacharozy;

• bufor octanowy, pH 4.5;

• odczynnik do oznaczania stężenia glukozy – odczynnik I

Sprzęt laboratoryjny

• spektrofotometr UV-VIS Shimadzu;

• termostatowane reaktory mieszalnikowe

Metodyka

Przygotowanie roztworów.

Przygotowanie substratu: Do cylindra miarowego wprowadzono 50 ml 2 M roztworu sacharozy oraz 50 ml 0,1 M buforu octanowego. Całość dobrze wymieszano. Następnie 50 ml świeżo przygotowanego roztworu wlano do kolejnego cylindra miarowego i uzupełniono buforem do 100 ml. Analogicznie przygotowano następne dwa roztwory (dwukrotne rozcieńczenie). Kolejne cztery roztwory przygotowano przez trzykrotne rozcieńczenie (15 ml roztworu sacharozy oraz 30 ml buforu).

Przygotowanie enzymu: Przygotowano 20 ml roztworu wyjściowego inwertazy o stężeniu 1 mg/ml w 0,1 M buforze octanowym. Otrzymany roztwór dobrze zamieszano. Następnie przygotowano przez rozcieńczenie 2 roztwory enzymu:

1 – do badań kinetycznych – 25x (2 ml E + 48 ml buforu);

2 – do procesu w reaktorze okresowym – 4x (2,5 ml E + 7,5 ml buforu) [7].

Oznaczenie stężenia glukozy testem enzymatycznym.

Do suchych, czystych i podpisanych probówek wprowadzono po 1 cm³ odczynnika do oznaczania glukozy. Następnie przygotowano 4 probówki na standard glukozy i kontrolę. Z reaktorów zawierających badane roztwory oraz z próbki zawierającej standard pobrano po 10 μl roztworu i wprowadzono do odczynnika (z reaktorów 8 i 9 pobrano po 50 μl). Całość wstawiono na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37°C, a następnie zmierzono absorbancję (500 nm) wobec próby kontrolnej zawierającej 1 ml odczynnika i 10 μl buforu octanowego [7].

Pomiar zmiany stężeń reagentów w początkowych etapach reakcji.

Przygotowano roztwory sacharozy o stężeniach:

Nr reaktora	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Csacharozy [M]	2,0	1,0	0,5	0,25	0,125	0,0417	0,0139	0,0046	0,0015

Do termostatowanych (35°C) reaktorów mieszalnikowych wprowadzono po 20 cm³ przygotowanych wcześniej roztworów, włączono mieszanie i zamknięto reaktory korkiem. Następnie po 10-15 minutach preinkubacji do reaktorów wprowadzono kolejno dokładnie po 4 ml roztworu enzymu (1), włączając jednocześnie stoper. Po 10-15 sec pobrano z reaktora dokładnie 10 μl (lub 50 μl) mieszaniny reakcyjnej i dodano ją do probówki zawierającej 1 cm³ odczynnika. Probówkę zamieszano i wstawiono na 5 minut do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni. Kolejne próbki do analiz pobierano po 1, 2, 3, 4 i 5 minucie lub po 2, 4, 6, 8 i 10 min (dla roztworów (1), (2) i (3)) [7].

Pomiar zmiany stężenia glukozy podczas procesu hydrolizy sacharozy.

Do termostatowanego (35°C) reaktora mieszalnikowego wprowadzono 20 cm³ przygotowanego wcześniej roztworu substratu nr 5, włączono mieszanie i zamknięto reaktor korkiem. Po 10 - 15 minutach preinkubacji do reaktora wprowadzono 4 ml roztworu enzymu (2), włączając jednocześnie stoper. Po 10 – 15 sec pobrano z reaktora 0,1 ml mieszaniny reakcyjnej i dodano ją do probówki zawierającej 0,4 cm³ buforu octowego o pH 4,5 (5-krotne rozcieńczenie próbek). Probówkę zamieszano i następnie pobrano z niej 10 μl i postępowano dalej jak opisano powyżej. Kolejne próbki do analiz pobierano po 5, 10, 15, 20 min, a następne co 10 min.

Wyjaśnienie skrótów

C_s,0 – stężenie początkowe substratu

C_s,0,rzecz – rzeczywiste początkowe stężenie substratu

C_s – stężenie substratu

C_g – stężenie glukozy obliczone z testu enzymatycznego

C_p – stężenie produktu (glukozy)

C_stand. - stężenie standardu glukozy

C_E – stężenie enzymu

A₅₀₀ – absorbancja przy długości fali 500 nm

r – szybkość reakcji

K_M – stała Michaelisa

V_max – szybkość maksymalna

K_is – stała inhibicji substratem

K_i – stała inhibicji produktem

k₃ – stała, liczba obrotów

t_rzecz. – czas rzeczywisty reakcji

t_model. – czas modelowy reakcji

t_{model.inh.sub.} – czas modelowy reakcji inhibicji substratem

t_{model.inh.prod} – czas modelowy inhibicji produktem

V_próbki – objętość pobranej próbki do badań z reaktora

V_s – objętość substratu

V_r – objętość roztworu (substratu + enzymu)

R - rozcieńczenie

α – stopień przereagowania

punkty w tabelach oznaczone na czerwono i na wykresach X zostały pominięte w dalszych obliczeniach, ponieważ znacząco zaburzały wyniki

Opracowanie wyników

1. Reaktory pracujące w początkowych warunkach reakcji

1. Zestawienie pomiarów C_stand. = 7,5 mM

• Reaktor 1 – C_s,0 = 2000 mM, V_próbki = 10 μl

trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs,0,rzecz [mM]	α [%]	r [mM/min]
0,38	0,079	1,42	1,42	1666,7	0,09%	0,458
2,10	0,128	2,30	2,30		0,14%
4,03	0,149	2,67	2,67		0,16%
5,93	0,220	3,95	3,95		0,24%
7,98	0,281	5,04	5,04		0,30%
9,98	0,323	5,80	5,80		0,35%

nr	A500,stand.
1	0,405
2	0,431
3	0,386
średnia	0,418

A500,substrat.	Cg,0 [mM]
0,000	0,000

• Reaktor 2 – C_s,0 = 1000 mM, V_próbki = 10 μl

trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs,0,rzecz [mM]	α [%]	r [mM/min]
0,37	0,060	1,04	1,04	833,3	0,12%	0,628
2,38	0,125	2,17	2,17		0,26%
3,92	0,161	2,79	2,79		0,34%
6,02	0,238	4,13	4,13		0,50%
7,95	0,305	5,29	5,29		0,63%
10,00	0,344	5,97	5,97		0,72%

nr	A500,stand.
1	0,510
2	0,431
3	0,434
średnia	0,433

A500,substrat.	Cg,0 [mM]
0,000	0,000

• Reaktor 3 – C_s,0 = 500 mM, V_próbki = 10 μl

trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs,0,rzecz [mM]	α [%]	r [mM/min]
0,38	0,024	0,40	0,40	416,7	0,10%	0,719
2,12	0,113	1,89	1,89		0,45%
4,10	0,196	3,27	3,27		0,78%
6,02	0,276	4,61	4,61		1,11%
8,10	0,384	6,41	6,41		1,54%
10,00	0,443	7,39	7,39		1,77%

nr	A500,stand.
1	0,450
2	0,449
3	0,427
średnia	0,450

A500,substrat.	Cg,0 [mM]
0,000	0,000

• Reaktor 4 – C_s,0 = 250 mM, V_próbki = 10 μl

trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs,0,rzecz [mM]	α %	r [mM/min]
0,38	0,028	0,44	0,44	208,3	0,21%	0,618
1,10	0,047	0,73	0,73		0,35%
2,08	0,110	1,71	1,71		0,82%
2,98	0,123	1,91	1,91		0,92%
3,95	0,169	2,63	2,63		1,26%
5,07	0,209	3,25	3,25		1,56%

nr	A500,stand.
1	0,484
2	0,485
3	0,477
średnia	0,482

A500,substrat.	Cg,0 [mM]
0,000	0,000

• Reaktor 5 – C_s,0 = 125 mM, V_próbki = 10 μl

trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs,0,rzecz [mM]	α %	r [mM/min]
0,18	0,009	0,14	0,14	104,2	0,13%	0,570
0,88	0,036	0,55	0,55		0,53%
1,97	0,075	1,15	1,15		1,10%
2,98	0,118	1,81	1,81		1,74%
4,12	0,151	2,31	2,31		2,22%
4,95	0,189	2,90	2,90		2,78%

nr	A500,stand.
1	0,478
2	0,506
3	0,484
średnia	0,489

A500,substrat.	Cg,0 [mM]
0,000	0,000

• Reaktor 6 – C_s,0 = 41,7 mM, V_próbki = 10 μl

trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs,0,rzecz [mM]	α %	r [mM/min]
0,22	0,001	0,02	0,02	34,8	0,04%	0,375
0,90	0,018	0,28	0,28		0,79%
1,87	0,046	0,71	0,71		2,03%
2,90	0,071	1,09	1,09		3,13%
3,93	0,085	1,30	1,30		3,75%
4,98	0,122	1,87	1,87		5,38%

nr	A500,stand.
1	0,485
2	0,500
3	0,482
średnia	0,489

A500,substrat.	Cg,0 [mM]
0,000	0,000

• Reaktor 7 – C_s,0 = 13,9 mM, V_próbki = 10 μl

trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs,0,rzecz [mM]	α %	r [mM/min]
0,30	0,005	0,083	-0,033	11,5	-0,29%	0,160
1,05	0,012	0,200	0,083		0,73%
2,02	0,023	0,383	0,266		2,32%
3,00	0,028	0,466	0,349		3,05%
4,00	0,042	0,699	0,582		5,08%
5,00	0,05	0,832	0,716		6,24%

nr	A500,stand.
1	0,448
2	0,466
3	0,438
średnia	0,451

A500,substrat.	Cg,0 [mM]
0,007	0,117

• Reaktor 8 – C_s,0 = 4,6 mM, V_próbki = 50 μl

trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs,0,rzecz [mM]	α %	r [mM/min]
0,25	0,005	0,016	0,013	3,80	0,34%	0,063
1,00	0,016	0,051	0,048		1,26%
2,00	0,035	0,113	0,109		2,85%
3,00	0,057	0,183	0,180		4,70%
4,00	0,078	0,251	0,248		6,46%
5,00	0,096	0,309	0,305		7,97%

nr	A500,stand.
1	0,468
2	0,487
3	0,500
średnia	0,485

A500,substrat.	Cg,0 [mM]
0,001	0,003

• Reaktor 9 – C_s,0 = 1,5 mM, V_próbki = 50 μl

trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs,0,rzecz [mM]	α %	r [mM/min]
0,25	0,002	0,007	-0,049	1,20	-4,13%	0,023
1,00	0,008	0,026	-0,030		-2,48%
2,00	0,016	0,053	-0,003		-0,28%
3,00	0,022	0,072	0,016		1,38%
4,00	0,028	0,092	0,036		3,03%
5,00	0,031	0,102	0,046		3,85%

nr	A500,stand.
1	0,445
2	0,496
3	0,482
średnia	0,474

A500,substrat.	Cg,0 [mM]
0,017	0,056

Przykładowe obliczenia

1. Obliczenie stężenia glukozy C_g:

$$C_{g} = \ \frac{A_{probki} \bullet C_{\text{stand.}}}{A_{\text{stand}}^{sr}} = \ \frac{0,079 \bullet 7,5}{0,418} = 1,42\ \lbrack mM\rbrack$$

Dla reaktora nr 8 i 9 należy uwzględnić rozcieńczenie:

$$C_{g} = \ \frac{A_{probki} \bullet C_{\text{stand.}}}{A_{\text{stand}}^{sr}}:5 \bullet \frac{1050}{1010} = \ \frac{0,005 \bullet 7,5}{0,485}:5 \bullet \frac{1050}{1010} = 0,016\ \lbrack mM\rbrack$$

1. Obliczenie stężenia produktu C_p:

C_p = C_g − C_g, 0 = 1, 42 − 0, 000 = 1, 42 [mM]

1. Obliczenie rzeczywistego początkowego stężenia substratu C_s,0,rzecz.:

$$C_{s,0,rzecz} = C_{s} \bullet \frac{V_{s}}{V_{r}} - C_{g,0} = 2000 \bullet \frac{20}{24} - 0,000 = 1666,7\ \lbrack mM\rbrack$$

1. Obliczenie stopnia przereagowania substratu α:

$$\alpha = \frac{C_{p}}{C_{s,0,rzecz}} \bullet 100\% = \frac{1,42}{1666,7} \bullet 100\% = 0,09\%$$

1. Wyznaczenie szybkości reakcji r na podstawie równania wykresu C_p = f(t):

y = 0,4579x + 1,2842

r – współczynnik kierunkowy prostej = 0,458 [mM/min]

1. Wyznaczenie wykresu Michaelisa – Menten oraz parametrów kinetycznych metodą regresji nieliniowej, korzystając z programu Origin Pro 8.0

Nr reaktora	Cs,0,rzecz [mM]	r [mM/min]	1/ Cs,0,rzecz	1/r
1	1666,67	0,458	0,0006	2,18
2	833,33	0,628	0,0012	1,59
3	416,67	0,719	0,0024	1,39
4	208,33	0,618	0,0048	1,62
5	104,17	0,570	0,0096	1,75
6	34,75	0,375	0,0288	2,66
7	11,47	0,160	0,0872	6,26
8	3,83	0,063	0,2611	15,80
9	1,19	0,023	0,8374	43,86

Na podstawie wykresu Michaelisa – Menten zakładamy, że reakcja jest reakcją inhibicji substratem.

Odrzucono punkty zbiegające się ku górze:

Wyznaczono parametry kinetyczne na podstawie równania wykresu Lineweavera – Burka , które użyto w programie Origin, jako parametry inicjalizacyjne:

$$\frac{1}{V} = \frac{K_{M}}{V_{\max}} \bullet \frac{1}{C_{s}} + \frac{1}{V_{\max}}\text{\ \ \ } < = > \ \ \ \frac{1}{r} = 50,946 \bullet \frac{1}{C_{s}} + \ 1,5162$$

$$\frac{1}{V_{\max}} = 1,5162\ \ \ = > \ \ \ V_{\max} = 0,660\ \lbrack\frac{\text{mM}}{\min}\rbrack$$

$$\frac{K_{M}}{V_{\max}} = 50,946\ \ \ = > \ \ \ K_{M} = 33,6\ \lbrack mM\rbrack$$

Z programu Origin Pro 8.0:

V_max = 0,99473 ± 0,05783 [mM/min]

K_M = 61,50153 ± 7,92394 [mM]

K_is = 1556,552 ± 246,1916 [mM]

Wykres zależności r = f(C_s)

1. Wyznaczenie stałej k₃

$$V_{\max} = C_{E} \bullet k_{3}\ \ \ \ \ \ = > \ \ \ \ \ \ \ k_{3} = \frac{V_{\max}}{C_{E}} = \frac{0,995}{0,040} = 24,9$$

$$C_{E} = \frac{C_{E,0}}{R} = \frac{1}{25} = 0,040\ \lbrack mM\rbrack$$

1. Weryfikacja danych w reaktorze okresowym

1. Zestawienie pomiarów

C_stand. = 7,5 mM

nr	A500,stand.
1	0,606
2	0,609
3	0,775
4	0,801
5	0,693
6	0,740
średnia	0,662

A500,substrat.	Cg,0 [mM]	Cs,0,rzecz. [mM]
0,144	8,16	96,01

C_s,0 = 125 mM

nr	trzecz. [min]	A500	Cg [mM]	Cp [mM]	Cs [mM]	α [%]
1	0,33	0,154	8,72	0,56	95,44	0,59
2	1,07	0,176	9,97	1,81	94,20	1,89
3	2,03	0,222	12,58	4,42	91,59	4,60
4	3,07	0,282	15,97	7,82	88,19	8,14
5	4,03	0,294	16,65	8,50	87,51	8,85
6	5,03	0,357	20,22	12,07	83,94	12,57
7	6,03	-	-	-	-	-
8	7,95	0,553	31,33	23,17	72,84	24,13
9	10,03	0,372	21,07	12,92	83,09	13,45
10	15,33	-	-	-	-	-
11	20,20	-	-	-	-	-
12	25,20	0,729	41,30	33,14	62,87	34,52
13	30,12	0,743	42,09	33,93	62,08	35,34
14	35,08	0,943	53,42	45,26	50,75	47,14
15	40,10	0,991	56,14	47,98	48,03	49,97
16	45,07	1,005	56,93	48,77	47,24	50,80
17	50,18	0,899	50,93	42,77	53,24	44,55
18	55,03	0,805	45,60	37,44	58,57	39,00
19	60,02	0,905	51,27	43,11	52,90	44,90
20	70,10	0,957	54,21	46,05	49,96	47,97
21	80,03	0,987	55,91	47,75	48,26	49,74
22	90,02	1,053	59,65	51,49	44,52	53,63
23	100,00	1,070	60,61	52,45	43,55	54,63
Średnia punktów 16-23	45,07	1,043	59,08	50,93	45,08	53,04

Przykładowe obliczenia

1. Obliczenie stężenia glukozy C_g:

$$C_{g} = \ \frac{A_{probki} \bullet C_{\text{stand.}}}{A_{\text{stand}}^{sr}} \bullet R = \ \frac{0,154 \bullet 7,5}{0,662} \bullet 5 = 8,72\lbrack mM\rbrack$$

1. Obliczenie stężenia produktu C_p:

C_p = C_g − C_g, 0 = 8, 72 − 8, 16 = 0, 56 [mM]

1. Obliczenie rzeczywistego początkowego stężenia substratu C_s,0,rzecz.:

$$C_{s,0,rzecz} = C_{s} \bullet \frac{V_{s}}{V_{r}} - C_{g,0} = 125 \bullet \frac{20}{24} - 8,16 = 96,01\ \lbrack mM\rbrack$$

1. Obliczenie stopnia przereagowania substratu α:

$$\alpha = \frac{C_{p}}{C_{s,0,rzecz}} \bullet 100\% = \frac{0,56}{96,01} \bullet 100\% = 0,59\%$$

1. Wyznaczenie parametrów kinetycznych równania

K_M = 61,5 mM (wartość wyznaczona z warunków początkowych reakcji)

K_is = 1556,6 mM (wartość wyznaczona z warunków początkowych reakcji)

V_max = C_E • k₃ = 0,250 • 24,9 = 6,23 [mM/min] (wartośc uległa zmianie, ponieważ jest inne stężenie enzymu)

$C_{E} = \frac{C_{E,0}}{R} = \frac{1}{4} = 0,250\ \lbrack mM\rbrack$

1. Wyznaczenie wykresu zależności C_p = f(t)

Po uśrednieniu punktów pomiarowych od 16 do 23, otrzymuje się wykres zależności C_p = f(t) dla reakcji przed wyczerpaniem substratu

1. Wyznaczenie wykresu zależności C_s = f(t) przed całkowitym wyczerpaniem substratu

2. Wyznaczenie czasu modelowego dla reakcji przed całkowitym wyczerpaniem substratu

nr	trzecz. [min]	Cs [mM]	tmodel. [min]	tmodel.inh.sub. [min]
1	0,33	95,44	0,15	0,15
2	1,07	94,20	0,48	0,50
3	2,03	91,59	1,17	1,22
4	3,07	88,19	2,09	2,17
5	4,03	87,51	2,28	2,36
6	5,03	83,94	3,26	3,37
7	6,03	-	-	-
8	7,95	72,84	6,45	6,65
9	10,03	83,09	3,50	3,62
10	15,33	-	-	-
11	20,20	-	-	-
12	25,20	62,87	9,50	9,77
13	30,12	62,08	9,75	10,03
14	35,08	50,75	13,56	13,90
15	40,10	48,03	14,54	14,89
16	45,07	45,08	15,64	16,01

Przykładowe obliczenia

1. Obliczenie czasu modelowego reakcji:

$$t_{\text{model}} = \frac{1}{V_{\max}} \bullet K_{M} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s}$$

$$t_{\text{model}} = \frac{1}{6,23} \bullet 61,5 \bullet \ln\left( \frac{96,01}{95,44} \right) + 96,01 - 95,44 = 0,15\ \lbrack min\rbrack$$

1. Obliczeniu czasu modelowego dla reakcji inhibicji substratem:

$t_{\text{model}} = \frac{1}{V_{\max}} \bullet K_{M} \bullet \ln\left( \frac{C_{0,s}}{C_{s}} \right) + C_{0,s} - C_{s} + \frac{1}{{2 \bullet K}_{\text{is}}} \bullet \left( C_{0,s}^{2} - C_{s}^{2} \right)$

$t_{\text{model}} = \frac{1}{6,23} \bullet 61,5 \bullet \ln\left( \frac{96,01}{95,44} \right) + 96,01 - 95,44 + \frac{1}{2 \bullet 1556,6} \bullet \left( {96,01}^{2} - {95,44}^{2} \right) = 0,15\ \lbrack min\rbrack$

Z wykresu można odczytać, że dla początkowych stężeń substratu spełnione jest założenie inhibicji substratem, ponieważ czas rzeczywisty pokrywa się z czasem modelowym. Jednak w miarę postępu reakcji, ubywania substratu i przyrostu produktu obserwuje się, że wartości odbiegają od siebie.

Z tego wniosku można założyć, że dla późniejszych warunków reakcji obecna jest inhibicja produktem.

1. Wyznaczenie parametrów kinetycznych dla reakcji inhibicji produktem metodą regresji nieliniowej, korzystając z programu Origin Pro 8.0

V_max = 6,23 ± 0,000 [mM/min]

K_M = 61,5 ± 0,000 [mM]

K_i = 7,04508 ± 0,28156 [mM]

Wykres zależności t = f(C_s)

1. Sprawdzenie czasu modelowego dla reakcji inhibicji produktem z czasem rzeczywistym reakcji

nr	trzecz. [min]	Cs [mM]	tmodel.inh.prod. [min]
1	0,33	95,44	0,15
2	1,07	94,20	0,50
3	2,03	91,59	1,32
4	3,07	88,19	2,57
5	4,03	87,51	2,84
6	5,03	83,94	4,43
7	6,03	-	-
8	7,95	72,84	11,16
9	10,03	83,09	4,85
10	15,33	-	-
11	20,20	-	-
12	25,20	62,87	20,09
13	30,12	62,08	20,94
14	35,08	50,75	36,05
15	40,10	48,03	40,65
16	45,07	45,08	46,17

Na podstawie wykresu można wywnioskować, że założony model inhibicji produktem jest poprawny. Czas rzeczywisty reakcji pokrywa się z czasem modelowym dla reakcji inhibicji produktem.

Wnioski

Celem doświadczenia było zapoznanie się z procedurą postępowania przy wyznaczaniu stałych równania kinetycznego reakcji hydrolizy sacharozy. Zamierzony cel ćwiczenia został osiągnięty: wyznaczono stałe Michaelisa K_M (61,5 mM), stałą inhibicji substratem K_is (1556,6 mM) oraz stałą inhibicji produktem K_i (7,05 mM). Określono także wartość szybkości maksymalnej dla inwertazy w reaktorach okresowym (6,23 mM/min).

Wyniki przedstawione w tabelach powyżej świadczą o tym, że inwertaza ma właściwości katalityczne.

Na podstawie pomiarów w przeprowadzonym doświadczeniu stworzono wykres zależności stężenia produktu od czasu C_p=f(t), z którego odczytano szybkości reakcji hydrolizy sacharozy przez inwertazę. Następnie po wykonaniu wykresów Michaelisa – Menten i Lineweavera – Burka zauważono, że kształty przedstawionych wykresów znacznie odbiega od standardowego kształtu. Ta obserwacja świadczy o niestandardowej kinetyce reakcji, enzym jest hamowany przez inhibitor. Założono że występuje inhibicja substratowa, ponieważ w tym przypadku szybkość reakcji maleje wraz ze wzrostem stężenia substratu. Wyznaczone parametry inicjalizacyjne V_max oraz K_M pozwoliły wyznaczyć z regresji nieliniowej stałą inhibicji substratem K_is oraz stałą k₃.

Uzyskane dane zweryfikowano w reaktorze okresowym. Na podstawie uzyskanych parametrów V_max oraz K_m wyznaczono czas modelowy reakcji przy założeniu występowania inhibicji substratem. Przedstawione wykresy t=f(C_s) przedstawiające czas rzeczywisty i modelowy pokrywają się tylko w początkowych stężeniach substratu. Świadczy to o tym, że w reakcji bierze udział inhibitor, którym jest substrat. Enzym pracuje dużo wolniej niż przewiduje to wykres modelowy. Jednakże im ilość substratu zmniejsza się wraz z biegiem czasu, tym reakcja biegnie szybciej. Z tym połączona jest obserwacja, że w dalszych etapach reakcji punkty znacznie odbiegają od siebie. Z tego powodu założono, że dla późniejszych warunków reakcji jest obecna inhibicja produktem. Tę hipotezę potwierdzono wykonując regresję nieliniową i wyznaczając K_i oraz czas modelowy inhibicji produktem. Po wykonaniu wykresu zależności t=f(C_s) wykresy przedstawiające czas modelowy i rzeczywisty pokrywają się, co oznacza że reakcja jest inhibitowana produktem.

Otrzymane wyniki doświadczenia mogły zostać obarczone błędem podczas ich wyznaczania z uzyskanych wyników, gdyż wiele punktów pomiarowych nie było branych pod uwagę do obliczeń, ponieważ znacząco odbiegały od pozostałych wartości. Powstałe w ten sposób odchylenia standardowe otrzymanych wartości mogły wynikać z niedokładności podczas wykonywania doświadczenia hydrolizy. Enzymatyczna metoda oznaczania stężenia glukozy jest mikrometodą. Taka metoda jest niezwykle czuła na minimalne zmiany stężenia. Z tego powodu różnice w otrzymanych wynikach mogły być spowodowane bardzo małymi niedokładnościami w pipetowaniu, które z kolei mogły skutkować niedokładnymi przygotowaniami próbek substratów, reagentów i produktów. To natomiast mogło być powodem otrzymania nieprawidłowych wyników absorbancji.

Literatura

[1] Instrukcja do zajęć laboratoryjnych – Biochemia I, Ćwiczenie E – Wpływ temperatury i pH na aktywność enzymów, Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny, Zakład Biochemii, Wrocław 2010, 10-11

[2] Filho UC., Hori CE., Ribeiro EJ., Influence of the reaction products in the inversion of sucrose by invertase, Brazilian Journal of Chemical Engineering, 16, 1999, 149-153

[3] Instrukcja do zajęć laboratoryjnych – Biochemia I, Ćwiczenie A – Kinetyka enzymatyczna I, Politechnika Wrocławska, Wydział Chemiczny, Zakład Biochemii, Wrocław 2010, 6-15

[4] Berg JM., Stryer L., Tymoczko JL., Biochemia, PWN, Warszawa 2003, 201-208

[5] Somiari RI., Bielecki S., Effect of fructose and glucose supplementation on invertase-mediated synthesis of oligosaccharides from sucrose, Biotechnology Letters, 17, 1995, 519-524

[6] Klimiuk E., Lossow K., Bulińska M., Kinetyka reakcji i modelowanie reaktorów biochemicznych w procesach oczyszczania ścieków, Akademia Rolniczo-Techniczna w Olsztynie, Olsztyn 1995, s. 81-82

[7] Instrukcja do zajęć: Wyznaczanie stałych równania kinetycznego reakcji hydrolizy sacharozy, 1-3