Wyznaczanie parametrów kinetyki reakcji enzymatycznej

za pomocą metod polarymetrycznych

Wprowadzenie

Inwertaza (sacharaza, β–fruktofuranozydaza) należy do hydrolaz i rozszczepia

wiązania β–glikozydowe w sacharozie tworząc glukozę i fruktozę. W trakcie hydrolizy
następuje zmiana kąta skręcenia roztworu. Wynika to stąd, że sacharoza jest prawoskrętna, a
mieszanina równych ilości glukozy i fruktozy lewoskrętna, gdyż wytworzona D–frukoza
silniej skręca w lewo niż D–fruktoza w prawo. Ponieważ następuje więc zmiana kąta
skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła na przeciwny, hydrolizę sacharozy nazwano
inwersją, a enzym katalizujący tę reakcję inwertazą.

Szybkość reakcji i aktywność inwertazy określać można przez oznaczenie

wzrastającego stężenia cukrów redukujących (glukoza i fruktoza), ale wygodniejsze w użyciu
jest polarymetryczne określanie zmian stężenia substratów (sacharozy). Chcąc określić ilość
rozłożonej w danej chwili sacharozy, dokonuje się pomiarów kąta skręcalności badanego
roztworu. Zmierzony kąt α będzie wynikiem skręcenia płaszczyzny polaryzacji przez
wszystkie znajdujące się w tej chwili w roztworze związki optycznie czynne:

α = α

1

+ α

2

+ α

3

1.

natomiast:

α



= α

s

·l·C

s

/100

2.

α

2

= α

g

·l·C

g

/100

3.

α

3

= α

f

·l·C

f

/100

4.

gdzie:
αs, αg, αf - skręcalność właściwa sacharozy, glukozy i fruktozy;
l - długość rurki polarymetrycznej (grubość warstwy cieczy) w dm;
Cs, Cg, Cf - stężenia sacharozy, glukozy i fruktozy w g/100 ml.

Wzór (1) przyjmuje więc postać:

100

C

l

100

C

l

100

C

l

f

f

g

g

s

⋅

⋅

+

⋅

⋅

+

⋅

⋅

=

α

α

α

α

s

5.

W trakcie hydrolizy z określonej ilości sacharozy powstają równoważne wagowo (w sumie)
ilości glukozy i fruktozy, oznaczając więc przez C

0

stężenie wagowe sacharozy na początku

pomiarów, mamy:

C

0

= C

s

+ C

g

+ C

f

,

6.

a ponieważ C

g

= C

f

, więc:

C

0

= C

s

+ 2·C

g,

7.

wyliczając stąd Cg otrzymujemy:

C

C

C

2

g

0

s

=

−

Uwzględniając równość (7), równanie (5) przyjmie postać:

100

1

2

C

2

C

)

(

100

C

l

s

0

f

g

s

⋅









−

⋅

+

+

⋅

⋅

=

α

α

α

α

s

8.

Po przekształceniach otrzymujemy:

f

g

f

g

α

α

α

α

α

α

−

−

+

−

=

s

0

2

)

(

C

l

200

C

Ponieważ αs = +66,5º, αg = +52,7º a αf = -92,4º, wzór na zawartość sacharozy w dowolnej
chwili trwania hydrolizy ma postać:

C

s

= 1,16*(α/l)+0,23*C

0

Dla określonych warunków pomiarów, wartości l i C

0

są stałe, więc stężenie sacharozy będzie

zawsze proporcjonalne do wykazanego przez polarymetr kąta skręcenia. Pamiętać jednak
należy, iż przy wyprowadzaniu wzoru pomięto zupełnie mutarotację powstających
cukrowców.

Inwertaza (sacharaza, β–fruktofuranozydaza) należy do hydrolaz i rozszczepia

wiązania β–glikozydowe w sacharozie tworząc glukozę i fruktozę. W trakcie hydrolizy
następuje zmiana kąta skręcenia roztworu. Wynika to stąd, że sacharoza jest prawoskrętna, a
mieszanina równych ilości glukozy i fruktozy lewoskrętna, gdyż wytworzona D–frukoza
silniej skręca w lewo niż D–fruktoza w prawo. Ponieważ następuje więc zmiana kąta
skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła na przeciwny, hydrolizę sacharozy nazwano
inwersją, a enzym katalizujący tę reakcję inwertazą.

Szybkość reakcji i aktywność inwertazy określać można przez oznaczenie

wzrastającego stężenia cukrów redukujących (glukoza i fruktoza), ale wygodniejsze w użyciu
jest polarymetryczne określanie zmian stężenia substratów (sacharozy). Korzysta się przy tym
z zależności wyprowadzonej w ćw. poprzednim.

Dokonując pomiarów początkowych szybkości reakcji dla różnych stężeń substratu,

można wyznaczyć stałą Michaelisa z wykresu Lineweavera-Burka. Stosowany zakres stężeń
substratów musi być oczywiście taki, aby szybkość reakcji wzrastała wraz ze wzrostem
stężenia (reakcja I rzędu). Przy nadmiarze substratu szybkość reakcji będzie stała (reakcja
zerowego rzędu), zależna tylko od niezmiennego w warunkach doświadczenia stężenia
enzymu.

Wykonanie doświadczenia

Przygotować 100 ml świeżego 10% roztworu sacharozy w buforze octanowym i do

50 ml roztworu dodać 0,1 ml roztworu inwertazy, wymieszać i szybko zmierzyć kąt
skręcenia. Pomiary powtarzać w 3, 6, 9 minucie doświadczenia.

Z pozostałej ilości świeżego 10% roztworu sacharozy sporządzić przez rozcieńczanie

5, 2,5 i 1,25% roztwory oraz przeprowadzić hydrolizę wobec takiej samej ilości enzymu.
Zanotować wyniki.

Opracowanie wyników

1. Wypełnić tabelę wyników dla każdego początkowego stężenia substratu:

Czas Skręcalność

α

Stężenie substratu C

s

Odchylenie

standardowe s

Współczynnik
zmienności W

Stężenie

produktu C

0

-C

s

Pomiar 1

Pomiar 2

średnia

0,5

3
6
9

2. Dla każdego roztworu sacharozy wykreślić zależność ilości wytworzonego produktu (Co–
Cs) od czasu.

3. Na każdym wykresie poprowadzić styczną do krzywej w pkt. t = 0 i wyznaczyć szybkość

początkową reakcji równą tg α.

C

0

- C

S

t

C

0

- C

S

= f(t)

4. Wypełnić tabelę wyników dla każdego początkowego stężenia substratu:

Co

1/v

1/C

o

v

5. Wykreślić wykres zależności 1/v od 1/C

s

dla równania Lineweavera-Burka. Jako szybkość

reakcji należy wziąć szybkości początkowe wyznaczone wg pkt. 3.

1/v

1/C

S

-1/K

m

1/v

max

6. Na podstawie współczynników regresji liniowej wyznaczyć stałą Michaelisa K

m.

i

maksymalną szybkość reakcji v

max

.

5. Na podstawie wyznaczonych parametrów K

m.

i v

max

wyliczyć wartości szybkości reakcji

enzymatycznej v dla badanych stężeń początkowych sacharozy Co i sporządzić wykres
Michaelisa-Menten. Zaznaczyć na wykresie wartości K

m.

i v

max

.

6. We wnioskach przedstawić wyniki końcowe: wyznaczone K

m.

i v

max

oraz przedstawić

swoje uwagi i spostrzeżenia dotyczące otrzymanych wyników i wykonania oznaczenia.