61

KINETYKA REAKCJI

ENZYMATYCZNEJ

ĆWICZENIE 4

62

Ćwiczenie 4

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

4. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ – STAŁA MICHAELISA

4.1. Podstawy teoretyczne

4.2. Wykonanie ćwiczenia

Podczas wykonywania poniższego ćwiczenia zamiast kolb miarowych stosujemy
probówki. Wykorzystując rozcieńczone roztwory można zaniedbać zjawisko kontrakcji
(popełniany błąd jest minimalny) i przyjąć, że suma objętości poszczególnych
roztworów stanowi całkowitą objętość roztworu.
Przed rozpoczęciem ćwiczenia studenci w grupie ustalają zakres czynności które będzie
wykonywał każdy z nich, ponieważ w trakcie wykonywania ćwiczenia należy dokładnie
kontrolować czas, którym wykonywane są poszczególne czynności.

A. Czynności wstępne

Student 1: Roztwór inwertazy
Drożdże świeże (0.5g) rozetrzeć w moździerzu z piaskiem, dodać 100ml wody
destylowanej, następnie przesączyć przez lejek zawierający niewielką ilość Celitu.
Pozostałość w zlewce i na lejku przemyć 100ml wody destylowanej. Supernatant,
zawierający inwertazę, stanowi materiał do ćwiczeń.

Student 2: Roztwory sacharozy o różnych stężeniach
Przygotować 100ml 0.2M roztworu sacharozy (M = 342 g/mol) w buforze octanowym.
Następnie należy przygotowany roztwór rozcieńczyć w krótkich probówkach według
poniższego schematu.

Rysunek 1

63

Ćwiczenie 4

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

Student 3: przygotowanie probówek z 10% roztworem NaOH (do zakończenia reakcji)
Przygotować 20 suchych, długich probówek i do każdej wprowadzić 2ml 10% r-ru
NaOH. Probówki opisać zgodnie z poniższym schematem:

Rysunek 2

B. Badanie kinetyki reakcji enzymatycznej

Student 1: Krzywa kalibracji
Do 5 długich probówek wprowadzić podane niżej objętości poszczególnych roztworów,
a następnie każdą probówkę poddać inkubacji przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej.
Po tym czasie zmierzyć wartość absorbancji (A) przy λ = 530nm wobec próby kontrolnej
(nr 0) (pomoc asystenta). Wyniki pomiarów zamieścić w tabeli.
Tabela 1

Nr

probówki

V

wz

[ml]

V

buforu

[ml]

V

NaOH

(10%)

[ml]

V

kw.pikr.

[ml]

A

530

C

glukozy-fruktozy

[g*dm

-3

]

0

0.0

1.0

2.0

2.0

1

0.2

0.8

2.0

2.0

2

0.4

0.6

2.0

2.0

3

0.6

0.4

2.0

2.0

4

0.8

0.2

2.0

2.0

5

1.0

0.0

2.0

2.0

64

Ćwiczenie 4

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

Student 2 i Student 3: Badanie kinetyki reakcji (wykonanie doświadczenia)

Każdy ze studentów wykonuje pomiar dla dwóch stężeń sacharozy (roztwory wcześniej
przygotowane przez Studenta 2)
Do 4 probówek należy odmierzyć po 3ml wcześniej przygotowanych roztworów
sacharozy o różnym stężeniu (przygotowanych wcześniej przez Studenta 2) dodać 3ml
supernatantu zawierającego enzym (przygotowanego przez Studenta 1). Natychmiast
po wymieszaniu pobrać 1 ml roztworu z każdej probówki i dodać do odpowiednio
oznaczonej probówki zawierającej 2ml 10% r-ru NaOH (t = 0) oraz dokładnie
wymieszać. Kolejne próbki należy pobrać po upływie 3, 7, 12 i 20 minut. Następnie do
wszystkich roztworów należy dodać 2ml r-ru kwasu pikrynowego. Wszystkie probówki
poddać inkubacji 5 minut we wrzącej łaźni wodnej.

Rysunek 3

65

Ćwiczenie 4

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

Rysunek 3 – cd

Pomiar absorbancji dla poszczególnych próbek wykonuje Student 1 zaraz po tym gdy
cała seria dla danego stężenia jest gotowa.
Dla każdej próby wykonać pomiar absorbancji (A) przy λ = 530nm wobec próby
kontrolnej (t = 0). Wyniki pomiarów zamieścić w poniższej tabeli.

Tabela 2

nr.

r-ru

C

n

[mol*dm

-3

]

Absorbancja (A) po czasie t [min]

3’

7’

12’

20’

1

0.2

2

0.1

3

0.05

4

0.025

66

Ćwiczenie 4

Pracownia z BIOCHEMII dla studentów III roku Wydziału Chemii UŁ

Po zakończeniu swoich czynności należy dokładnie umyć sprzęt wielokrotnego użytku
umyć wodą z płynem do mycia (zmazać oznaczenia), wodą oraz acetonem i wysuszyć w
suszarce.

4.3.

Wyznaczenie

parametrów

kinetycznych

reakcji

enzymatycznej

(przygotowanie sprawozdania)



Napisanie równań reakcji przeprowadzanych podczas doświadczenia (hydroliza
sacharozy, reakcja glukozyz kwasem pikrynowym: bilans jonowo-elektronowy
reakcji redoks).



Zamieszczenie uzupełnionych tabel 1-3. Z krzywej wzorcowej należy odczytać
stężenie [g*dm

-3

] glukozy-fruktozy odpowiadających poszczególnym wartościom

absorbancji.

Tabela 3

nr.

r-ru

C

n

[mol*dm

-3

]

C

glukozy-fruktozy

[g*dm

-3

]

3’

7’

12’

20’

1

0.2

2

0.1

3

0.05

4

0.025



Sporządzenie wykresów dla każdego ze stężeń: C

glukozy-fruktozy

= f(t) (4 wykresy).

Wyznaczenie v

0

dla każdego ze stężeń (tangens kąta nachylenia stycznej do wykresu

C

glukozy-fruktozy

= f(t) w punkcie t = 0).

v

0

= tg α = x/y = c/t [g*dm

-3

*min

-1

]



Wykreślenie krzywej Michaelisa- Menten (zależność v

0

= f(C

substratu

) ).



Wyznaczenie z wykresu Michaelisa-Menten stałej K

m

(stężenie substratu, przy którym

szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę wartości szybkości maksymalnej
½*v

max

).



Wykreślanie prostej Lineweavera- Burka (1/v

0

= f(1/C

substratu

) ).



Wyznaczenie

stałej

Miachaelisa

(K

m

)

z

prostej

Lineweavera–Burka

(tg α = K

m

/v

max

; w punkcie przecięcia prostej z osią rzędnych można odczytać wartość

1/ v

max

, natomiast w punkcie przecięcia z osią odciętych wartość –1/K

m

).

Uwaga:
W sprawozdaniu należy umieścić wszystkie wzory wykorzystywane podczas obliczeń,
obliczenia itp.